慢性疲勞綜合征與XMRV關(guān)系之爭＊

張擁軍

2011年12月23日，美國《科學(xué)》雜志罕見地在未征得當(dāng)事人同意的情況下，宣布全部撤銷了2009年刊登的一篇文章［1］，至此，這場吸引國際上眾多科學(xué)家參與、歷時(shí)兩年多的慢性疲勞綜合征與XMRV關(guān)系的爭論落下帷幕。本文擬對(duì)這一事件的來龍去脈進(jìn)行綜述，及時(shí)澄清可能產(chǎn)生的一些誤導(dǎo)，探討該事件對(duì)今后病原生物學(xué)研究領(lǐng)域的啟迪。

1 起因——XMRV與慢性疲勞綜合征相關(guān)假說的提出

1．1 慢性疲勞綜合征 慢性疲勞綜合征（chr onic fatigue syndrome，CFS）又稱為肌痛性腦脊髓炎（myal gic encephalo myelitis，ME），是一種以慢性疲勞為主要表現(xiàn)的臨床綜合征。主要癥狀包括持續(xù)6個(gè)月以上不明原因的持續(xù)性疲勞，活動(dòng)能力的顯著下降，即使適度休息也不能減輕。出現(xiàn)記憶力下降、睡眠障礙、全身關(guān)節(jié)和肌肉疼痛、咽喉酸痛、頭痛、淋巴結(jié)觸痛等癥狀，還可能出現(xiàn)其它癥狀如腹痛、惡心、腹瀉、胸痛、對(duì)光聲音和氣味敏感、抑郁、易激惹、焦慮等［2－4］。據(jù)估計(jì)，全球有大約1 700萬不同程度的CFS病例，多為女性，男女比例為1∶6［4］。

關(guān)于CFS的致病因子，多年來一直沒有定論。曾經(jīng)有人提出過CFS產(chǎn)生及癥狀持續(xù)的生物學(xué)、遺傳學(xué)、感染以及心理學(xué)機(jī)制，其中候選的感染因子有EB病毒、腸道病毒、細(xì)小病毒B19、博爾納病毒、貝氏柯克斯體、肺炎衣原體等，均告失敗［2－4］。因此，CFS病例缺乏具有診斷價(jià)值的特征性異常指標(biāo)。

目前CFS研究中，廣泛采用的是1994年美國CDC修訂的診斷標(biāo)準(zhǔn)。在CFS的治療方面，藥物治療的作用十分有限［3］，也不存在特異性治療藥物。

1．2 XMRV 異嗜性鼠白血病病毒相關(guān)病毒（xenotr opic murine leukemia vir us－related vir us，XMRV）為單股RNA病毒，屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科，γ－逆轉(zhuǎn)錄病毒屬，同屬的還有鼠白血病病毒（MLV）、Friend病毒、貓白血病病毒（FLV）等。XMRV基因組全長約8100個(gè)核苷酸，與多種小鼠的內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒同源性達(dá)95%，而與部分小鼠外源性病毒相似性為93%～94%［5］。2006年首次發(fā)現(xiàn)XMRV，并認(rèn)為該病毒感染與前列腺癌存在一定聯(lián)系。

1．3 2009年《科學(xué)》論文 2009年10月，美國內(nèi)華達(dá)州 Whittemore Peterson研究所（WPI）的 Mikovits實(shí)驗(yàn)室在《科學(xué)》雜志發(fā)表《在CFS患者血液細(xì)胞中感染性逆轉(zhuǎn)錄病毒XMRV的檢測》一文，首次宣布了該實(shí)驗(yàn)室的研究成果［1］。他們發(fā)現(xiàn)從101例CFS患者外周單核細(xì)胞（PBMCs）中，有68例（67%）檢測到XMRV的gag基因序列，而218名健康對(duì)照僅檢出8例（3．7%）。而且，他們的合作實(shí)驗(yàn)室——CCF的Sil ver man實(shí)驗(yàn)室也通過PCR擴(kuò)增和序列測定證實(shí)了11例WPI提供的CFS樣品中，有7例患者的PBMC DNA中檢測到352nt的XMRV env基因片段和736 nt的gag基因片段。同時(shí)，他們還采用流式細(xì)胞儀和蛋白印跡的方法測定了患者PBMC中XMRV的蛋白表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)從一名患者PBMC分離的T細(xì)胞和B細(xì)胞經(jīng)過活化，能夠感染XMRV。細(xì)胞培養(yǎng)也顯示來自患者的XMRV具有感染性，病毒可能通過細(xì)胞和無細(xì)胞傳播。未感染的原代淋巴細(xì)胞及指示細(xì)胞系暴露于激活的CFS患者PBMCs、B細(xì)胞、T細(xì)胞或血漿均可引起繼發(fā)感染。根據(jù)以上幾個(gè)方面的事實(shí)，作者認(rèn)為XMRV可能是CFS致病的促進(jìn)因子。

這篇論文在《科學(xué)》雜志發(fā)表后，立即受到全世界新聞媒體、病毒學(xué)及CFS臨床和研究領(lǐng)域的高度關(guān)注。雖然少數(shù)學(xué)者仍然持懷疑態(tài)度，一些知名學(xué)者還是根據(jù)文章里提供的數(shù)據(jù)肯定了這項(xiàng)發(fā)現(xiàn)的重要意義。而2010年8月，美國國立衛(wèi)生研究院（NI H）、食品藥品管理署（FDA）以及哈佛大學(xué)的研究人員聯(lián)合發(fā)表在美國《國家科學(xué)院院刊》的論文，也支持了《科學(xué)》論文中類似的觀點(diǎn)［6］。雖然他們檢測到的不是XMRV本身的序列，但他們發(fā)現(xiàn)90年代中期，哈佛大學(xué)CFS專家Ant hony Ko mar off收集的37名CFS患者樣品（PBMC和全血）中，有32名（87%）可以檢測到 MLV相關(guān)病毒（MLV－related vir us）的gag基因序列，而44名健康對(duì)照僅3名（6．8%）陽性。

1．4 影響 這篇論文的問世，迅速在生物醫(yī)學(xué)多個(gè)領(lǐng)域產(chǎn)生了巨大影響。在CFS研究領(lǐng)域，研究人員正苦于找不到合適的生物致病因子作為診斷指標(biāo)，因此當(dāng)務(wù)之急是盡快證實(shí)該病毒在本地CFS研究人群中的檢出率，以便及時(shí)調(diào)整研究方向和策略，有針對(duì)性地研制相應(yīng)的治療藥物；對(duì)診斷試劑廠商來說，無疑是一個(gè)新的商機(jī)。盡快研發(fā)特異而穩(wěn)定的診斷試劑，意味著早日占領(lǐng)市場，最初的診斷試劑就一度超過600美元；對(duì)血液中心，如果CFS患者XMRV感染率較高，病毒是否會(huì)通過輸血傳播，直接關(guān)系到輸血安全。因此需要對(duì)獻(xiàn)血員進(jìn)行篩查，并考慮是否應(yīng)該對(duì)CFS患者獻(xiàn)血采取限制措施；而對(duì)CFS患者，一旦證實(shí)XMRV感染是致病元兇，就可能結(jié)束CFS無藥可治的困境，也意味著可以嘗試一些抗逆轉(zhuǎn)錄藥物治療。為了早日康復(fù)，甚至有患者已經(jīng)迫不及待地開始自行服用這類藥物。

2 質(zhì)疑——令人失望的XMRV檢出率

然而，《科學(xué)》論文刊出后不久，接踵而至的質(zhì)疑估計(jì)作者始料未及。盡管沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)試劑，世界各地一直致力于CFS致病因子研究的團(tuán)隊(duì)立即創(chuàng)建了各自的相關(guān)檢測體系，重新檢測現(xiàn)有患者樣品中XMRV。令人驚奇的是，得到的檢出率與該文結(jié)果大相徑庭。其中，英國倫敦帝國大學(xué)的 Mc－Cl ure實(shí)驗(yàn)室［7］率先報(bào)告了他們的陰性結(jié)果。他們從186名CFS患者血液樣品中提取DNA，用套式PCR的方法檢測可能存在的XMRV前病毒序列，但沒有發(fā)現(xiàn)任何XMRV或MLV相關(guān)序列。而后，英國國家醫(yī)學(xué)研究所也報(bào)告了類似結(jié)果［8］。他們檢測了170名CFS患者及395名對(duì)照的樣品，用PCR方法未能從299份樣品（患者及健康對(duì)照）中檢測到XMRV相關(guān)DNA，血清學(xué)方法從565份樣品中發(fā)現(xiàn)26份有中和抗體陽性，但只有1份為CFS病例。幾乎同時(shí)，荷蘭學(xué)者［9］對(duì)76名CFS患者及69名對(duì)照PBMC，采用實(shí)時(shí)熒光PCR檢測X MRV整合酶基因及套式PCR檢測gag基因，也沒有檢測到XMRV序列。除了CFS人群，為了確定CFS獻(xiàn)血員或其它人群中是否存在XMRV，保障輸血安全，各國研究人員還對(duì)部分獻(xiàn)血員血樣進(jìn)行了篩查，普遍得到極低的檢出率［10］。因此，隨著一系列陰性結(jié)果的出爐，人們逐漸開始懷疑該論文的結(jié)果，如此懸殊的檢出率，究竟是XMRV毒株的變異？患者群體的差異（地域、種屬、病例標(biāo)準(zhǔn)）？還是實(shí)驗(yàn)室污染？而面對(duì)蜂擁而至的質(zhì)疑，Mikovits實(shí)驗(yàn)室［11］強(qiáng)調(diào)這些陰性結(jié)果采用的檢測方法和實(shí)驗(yàn)步驟與他們論文中描述的不完全一致，尤其是樣品DNA不是來自經(jīng)過活化的PBMC，檢出率會(huì)低一些。

3 驗(yàn)證——多家實(shí)驗(yàn)室參與的聯(lián)合調(diào)查

為了打消公眾的疑慮，準(zhǔn)備平行盲樣、采用敏感性相當(dāng)?shù)臋z測方法、同時(shí)在多家實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測得出的結(jié)果才最具有說服力。美國CDC［12］采集了51例CFS患者及56名健康人血樣，CDC的實(shí)驗(yàn)室采用蛋白印跡實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)51例CFS及53名對(duì)照均為陰性，德國的羅伯特．郭霍研究所（Robert Koch－Instit ute，RKI，為德國聯(lián)邦公共衛(wèi)生機(jī)構(gòu)）實(shí)驗(yàn)室采用ELISA方法發(fā)現(xiàn)51例CFS及53名對(duì)照各有一例弱陽性；而CDC實(shí)驗(yàn)室還用套式PCR方法檢測病毒gag和env基因，50名CFS患者、56名對(duì)照、41名獻(xiàn)血員全部陰性；美國加州一家實(shí)驗(yàn)室也獲得了同樣的PCR結(jié)果。這樣的結(jié)果顯然不支持XMRV與CFS存在聯(lián)系。隨后，NI H組織了9個(gè)實(shí)驗(yàn)室（其中包括來自 WPI、NI H、CDC、FDA等機(jī)構(gòu)的實(shí)驗(yàn)室）參與的盲樣測試［13］。他們采集了15名以前報(bào)道XMRV／MLV陽性的血樣（其中14例為CFS），以及15名先前報(bào)道陰性的健康獻(xiàn)血員，編號(hào)，以盲樣分發(fā)給9家實(shí)驗(yàn)室，檢測XMRV／MLV核酸、病毒復(fù)制和抗體。結(jié)果僅2家實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)XMRV／MLVs相關(guān)證據(jù)；盡管所有實(shí)驗(yàn)方法對(duì)CFS樣品及陰性對(duì)照的敏感性相似，得到的平行樣品結(jié)果卻不一致，說明目前血樣中XMRV／MLV的檢測方法重復(fù)性較差，不足以用于獻(xiàn)血員篩查。另外，一項(xiàng)規(guī)模更大、由哥倫比亞大學(xué)Ian Lipkin實(shí)驗(yàn)室率領(lǐng)的調(diào)查仍然在進(jìn)行中，該項(xiàng)目由NI H下屬的國家過敏及傳染性疾病研究所（NIAID）資助，有WPI、NI H及CDC幾家實(shí)驗(yàn)室參與，測試對(duì)象來自150名CFS患者、150名健康對(duì)照樣品，患者群體分別來自6個(gè)美國臨床機(jī)構(gòu)［14］。

4 證據(jù)——假陽性的源頭

但2010年底，陸續(xù)出現(xiàn)一系列不利于Mikovits實(shí)驗(yàn)室的證據(jù)，實(shí)驗(yàn)室污染源頭包括樣品制備、試劑及細(xì)胞系本身等多個(gè)因素［15－19］。

首先，樣品制備過程中可能出現(xiàn)污染，尤其是鼠源DNA污染。對(duì)于經(jīng)常開展小鼠細(xì)胞系（如NI H3 T3）及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)室來說，鼠源DNA無處不在，因此在采血、PBMC分離以及DNA純化步驟，極有可能混入鼠源DNA。最初的質(zhì)疑多數(shù)采用PCR擴(kuò)增XMRV相關(guān)片段的方法（傳統(tǒng)PCR、RTPCR、套式PCR或?qū)崟r(shí)熒光PCR等），因此又暴露出一系列來自PCR試劑的污染源。由于PCR突出的擴(kuò)增效率，尤其是套式PCR需要對(duì)首輪產(chǎn)物進(jìn)行二次擴(kuò)增，在提高了檢測靈敏度的同時(shí)，也增加了假陽性的風(fēng)險(xiǎn)。美國CDC的實(shí)驗(yàn)室［15］調(diào)查發(fā)現(xiàn)，6個(gè)廠家的重組逆轉(zhuǎn)錄酶，無論是來自MLV還是A MV，都存在MLV的pol基因DNA序列，而不是gag基因或小鼠DNA。由于序列分析顯示與Moloney MLV高度相關(guān)，推測是存在含RTase基因的質(zhì)粒污染。而一些商業(yè)化PCR試劑盒中，采用了熱啟動(dòng)Taq DNA聚合酶，其中關(guān)鍵的單克隆抗體，制備過程中可能會(huì)帶來痕量小鼠DNA［16］。這些痕量小鼠DNA的存在，很難排除一些小鼠內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒前病毒的污染，因此對(duì)先前從CFS患者樣品檢出X MRV／MLV序列的結(jié)果高度懷疑。

然而，更加致命的證據(jù)是發(fā)現(xiàn)細(xì)胞系受到污染。PNAS論文發(fā)表后，英國學(xué)者［18］就通過序列分析，發(fā)現(xiàn)前列腺癌細(xì)胞系22 Rv1中的X MRV序列是所有CFS患者序列的祖先，PCR檢測到的患者XMRV片段可能是小鼠DNA污染所致，22Rv1細(xì)胞系可能在裸鼠體內(nèi)移植過程中感染了XMRV。隨后，幾家美國實(shí)驗(yàn)室合作［19］，通過對(duì)22 Rv1相關(guān)的一系列細(xì)胞系遺傳背景的研究，發(fā)現(xiàn)最初的人類前列腺癌細(xì)胞系CWR22并不存在XMRV。在小鼠體內(nèi)傳代過程中，前病毒Pre－XMRV1與 Pre－XMRV2發(fā)生重組，現(xiàn)在常用的22Rv1細(xì)胞系中的XMRV實(shí)際為兩種小鼠內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒重組的產(chǎn)物。而且，通過分析這些前病毒在小鼠基因組染色體位點(diǎn)以及整合位點(diǎn)等資料，發(fā)現(xiàn)Pre－XMRV1主要存在于亞洲小鼠，而Pre－XMRV2存在于歐洲小鼠。沒有任何一個(gè)野生小鼠系同時(shí)含有這兩種前病毒，僅在3個(gè)實(shí)驗(yàn)小鼠品系中同時(shí)存在這兩種前病毒［20］。另外，針對(duì)PNAS論文中檢測到的相隔15年的CFS患者病毒序列，英國學(xué)者同樣通過序列分析［21］，發(fā)現(xiàn)在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的患者序列代表的是完全不同的內(nèi)源性小鼠逆轉(zhuǎn)錄病毒，顯然不符合逆轉(zhuǎn)錄病毒在患者體內(nèi)的進(jìn)化模式，表明存在污染。

雖然面對(duì)質(zhì)疑，有兩位這篇《科學(xué)》論文的作者后來在重復(fù)檢測樣品時(shí)，發(fā)現(xiàn)部分CFS患者PBMC DNA提取過程中存在XMRV質(zhì)粒的污染，于2011年10月同意對(duì)該文部分撤稿，其余作者仍然不同意全部撤稿。在12月23日《科學(xué)》正式撤稿出臺(tái)后，12月28日唯一支持該文的PNAS論文也被撤稿。

5 XMRV事件的反思

前后持續(xù)了兩年多的XMRV與CFS關(guān)系之爭，為了證明這個(gè)假說的真?zhèn)危瑺可媪硕鄠€(gè)國家眾多研究人員參與。對(duì)于病原生物學(xué)領(lǐng)域來說，尤其是今后提出任何新的病原體感染與人類疾病的關(guān)系，這場爭論值得研究人員反思。首先，需要隨時(shí)警惕實(shí)驗(yàn)室污染。這次事件的調(diào)查表明，除了偶爾操作不當(dāng)可能引入污染，一些廠商的PCR試劑（DNA聚合酶和逆轉(zhuǎn)錄酶）也可能會(huì)有痕量的鼠源DNA污染，同時(shí)，一些關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)步驟中新引進(jìn)的細(xì)胞系，必須清楚其來源及傳代背景。其次，不要迷信權(quán)威。雖然這次事件的始作俑者是一家不知名的私立實(shí)驗(yàn)室，但在質(zhì)疑聲中，也有一些知名科學(xué)家以及部分FDA、NI H的實(shí)驗(yàn)室參與，甚至輕率地得出了錯(cuò)誤的結(jié)論，使質(zhì)疑過程拖延了過長時(shí)間。再次，今后提出任何新的病原體感染與人類疾病關(guān)系的假說，都需要嚴(yán)格遵循“郭霍原則”或者“分子郭霍原則”，并進(jìn)行嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)證明，謹(jǐn)慎得出結(jié)論，以免誤導(dǎo)公眾。

［1］Lo mbardi VC，Ruscetti FW，Das Gupta J，etal．Detection of an infectious retr ovir us，XMRV，in blood cells of patients with chronic fatigue syndro me［J］．Science，2009，326（5952）：585－589．DOI：10．1126／science．1179052

［2］Centers for Disease Contr ol and Prevention．Chronic Fatigue Syndro me［EB／OL］．［2012－02－07］．htt p：／／www．cdc．gov／cfs／general／sy mpto ms／index．ht ml．

［3］Wikipedia．Chronic fatigue syndrome［EB／OL］．［2012－02－07］．http：／／en．wikipedia．org／wiki／Chronic＿fatigue＿syndrome

［4］Devanur LD，Kerr JR．Chronic fatigue syndrome［J］．J Clin Virol，2006，37（3）：139－150．DOI：10．1016／j．jcv．2006．08．013

［5］Wikipedia．Xenotropic murine leukemia virus－related virus［EB／OL］．［2012－02－07］．http：／／en．wikipedia．org／wiki／Xenotropic＿murine＿leukemia＿virus－related＿virus

［6］Lo SC，Pripuzova N，Li B，etal．Detection of MLV－related virus gene sequences in blood of patients with chronic fatigue syndrome and healthy blood donors［J］．Proc Natl Acad Sci U S A，2010，107（36）：15874－15879．DOI：10．1073／pnas．1006901107

［7］Erl wein O，Kaye S，Mc Cl ure MO，etal．Failure to detect the novel retrovirus XMRV in chronic fatigue syndrome［J］．PLoS One，2010，5（1）：e8519．DOI：10．1371／journal．pone．0008519

［8］Groom HC，Boucherit VC，Makinson K，etal．Absence of xenotropic murine leukaemia virus－related virus in UK patients with chronic fatigue syndrome［J］．Retrovirology，2010，15（7）：10．DOI：10．1186／1742－4690－7－10

［9］van Kuppeveld FJ，de Jong AS，Lanke KH，etal．Prevalence of xenotropic murine leukae mia vir us－related vir us in patients wit h chronic fatigue syndr o me in the Netherlands：retrospective analysis of sa mples from an established cohort［J］．BMJ，2010，340：c1018．DOI：10．1136／b mj．c1018

［10］Dodd RY，Hackett Jr J，Linnen JM，etal．Xenotropic murine leuke mia vir us－related vir us does not pose a risk to blood recipient safety［J］．Transf usion，2012，52（2）：298－306．DOI：10．1111／j．1537－2995．2011．03450．x．

［11］Mikovits JA，Lo mbardi VC，Pf ost MA，etal．Detection of an infectious retr ovir us，X MRV，in blood cells of patients wit h chr onic fatigue syndr o me［J］．Vir ulence，2010，1（5）：386－390．DOI：10．1126／science．1179052

［12］Switzer WM，Jia H，Hohn O，etal．Absence of evidence of xenotr opic murine leukemia vir us－related vir us infection in persons wit h chronic fatigue syndr o me and healt hy controls in the United States［J］．Retrovir ology，2010，7：57．DOI：10．1186／1742－4690－7－57

［13］Si mmons G，Glynn SA，Ko mar off AL，etal．Fail ure to confir m X MRV／MLVs in the blood of patients wit h chr onic fatigue syndr o me：a multi－laboratory study［J］．Science，2011，334（6057）：814－817．DOI：10．1126／science．1213841

［14］Kaiser J．Chronic fatigue syndro me．St udies point to possible conta mination in X MRV findings［J］．Science，2011，331（6013）：17．DOI：10．1126／science．331．6013．17

［15］Zheng H，Jia H，Shankar A，etal．Detection of murine leukemia vir us or mouse DNA in co mmercial RT－PCR reagents and hu man DNAs［J］．PLoS One，2011，6（12）：e29050．DOI：10．1371／journal．pone．0029050

［16］Weiss RA．A cautionar y tale of vir us and disease［J］．BMC Biol，2010，8：124．DOI：10．1186／1741－7007－8－124

［17］Sat o E，F(xiàn)ur uta RA，Miyazawa T．An endogenous murine leukemia viral geno me conta minant in a co mmercial RT－PCR kit is a mplified using standar d pri mers for X MRV［J］．Retrovirology，2010，7：110．DOI：10．1186／1742－4690－7－110

［18］HuéS，Gray ER，Gall A，etal．Disease－associated X MRV sequences are consistent wit h laboratory conta mination［J］．Retrovir ology，2010，7（1）：111．DOI：10．1186／1742－4690－7－111

［19］Papr otka T，Delviks－Frankenberry KA，Cing?z O，etal．Reco mbinant origin of the retr ovir us XMRV［J］．Science，2011，333（6038）：97－101．DOI：10．1126／science．1205292

［20］Cing?z O，Paprot ka T，Delviks－Frankenberry KA ，etal．Characterization，mapping，and distribution of the t wo XMRV parental pr ovir uses［J］．J Vir ol，2012，86（1）：328－338．DOI：10．1128／JVI．06022－11．

［21］Katzourakis A，HuéS，Kellam P，etal．Phylogenetic analysis of murine leukemia virus sequences from longitudinally sampled chronic fatigue syndrome patients suggests PCR contamination rather than viral evol ution［J］．J Virol，2011，85（20）：10909－10913．DOI：10．1128／JVI．00827－11