熒光雙染和三維重建技術對蠕形螨的形態觀察和功能探討＊

佘俊萍，張錫林，王光西，孫 源，王利芳，胡朝惠

蠕形螨寄生于人和哺乳動物的毛囊和皮脂腺內，已知有140余種和亞種，寄生于人體的主要有毛囊蠕形螨（Demodex f olliculorum）和皮脂腺蠕形螨（Demodex brevis）兩種，感染以毛囊蠕形螨為主［1］。國內人群感染率在0．8%～81%［2］，以顏面、鼻唇溝［3］，額，眼瞼和胸背等部位多見，臨床常導致皮膚瘙癢、丘疹、脂溢性皮炎、痤瘡、酒渣鼻等。毛囊蠕形螨個體微小（100～400μm），比重輕、透明且脆弱，體表附厚重皮脂，這些因素成為研究其形態、結構及其生物學功能等特性的瓶頸。徐蔭祺［4］、丁曉昆［5］曾用普通掃描電鏡（scanning electron microscope，SEM）對人體蠕形螨進行觀察，近年，趙巖等［6］、劉瑩等［7］、馮新玉等［8］也通過掃描電鏡對人體蠕形螨超微形態進行了補充研究，但均對一些具分類、功能意義的結構觀察還不夠，影響了蟲種鑒別及致病機制的研究。

激光掃描共聚顯微鏡（confocal laser scanning microscope，CLSM）的工作原理是在熒光顯微鏡成象的基礎上，利用共聚焦光路和激光掃描獲得樣品的顯微圖像，經過計算機進行圖象處理，獲得細胞或組織內部結構的熒光圖像。激光掃描共聚焦顯微鏡具有高靈敏度和能觀察空間結構的獨特優點，從而對被檢樣品從停留在表面、單層、靜態局面的觀察進展到立體、斷層掃描、動態全面的觀察，并已在生命科學研究中得迅速的應用，為該領域新一代強有力的研究工具。本實驗采用CLSM對人體毛囊蠕形螨進行三維形態學觀察，嘗試觀測蟲體的進一步形態和結構。

1 材料和方法

1．1 取材方法 在瀘州醫院附院皮膚科采集患者鼻部皮脂，采用自制刮取式取螨器、挑螨針作為取螨工具，以早先建立的方法［9］，選用2% （安利）餐具洗潔精作為皮脂、脂肪溶解劑，用凹玻片作為清洗容器，從受檢者皮脂分泌物中快速分出清潔的活毛囊螨置于1．5 mL離心管中，50支／管，75%酒精固定，－4℃保存備用。

1．2 實驗 激光共聚焦顯微鏡為Leica TCS SPE，5810R／5804R冷凍離心機為 Gene Company Li mited，碘化丙啶（propidiu m iodide，PI）購自Sigma公司，異硫氰酸 （fluorescein isothiocyanate，FITC），購自美國Bio Legend公司，2．5%戊二醛等其他試劑購自上海生物工程技術服務有限公司。

1．3 實驗方法 將盛有毛囊螨的離心管離心30 s，1 000 r／min棄上清，吸取管底的毛囊蠕形螨均勻涂在用多聚賴氨酸處理過的玻片中央進行固定，待酒精揮發后，滴加用PBS稀釋10倍的FITC進行初染，37℃，恒溫培養箱孵育2 h，用0．01 mol／L的PBS洗滌2次，5 min／次，再滴加5μg／ml PI室溫避光15 min復染，用0．01 mol／L的PBS洗滌4次，5 min／次。稍晾干后，滴加80%甘油封片蓋上蓋玻片，用激光共聚焦顯微鏡進行觀察，選取蟲體不同部位、不同角度、不同層面進行連續光學切片，并使用Imaris 5．0軟件進行三維重建。

2 結 果

2．1 激光掃描共聚焦顯微鏡連續光學切片激光掃描共聚焦顯微鏡以每0．2μm厚度對完整蟲體進行從上到下連續光學切片，獲得到45張圖片（圖1）。

圖1 激光掃描共聚焦顯微鏡下蟲體連續光學切片Fig．1 Serial optical sections of DF by CLSM

實驗發現，蟲體與FITC和PI均有很強的結合力。在激發光下，熒光信號將蟲體形態清晰的展現出來。蟲體蛋白與FITC結合在激發光束的作用下發出綠色熒光，蟲體細胞核與PI結合后在在激發光束的作用下發出紅色熒光。清晰可見毛囊蠕形螨的細微結構，比單純使用PI或FITC染色效果更佳。選取蟲體不同部位、角度、不同層面進行斷層掃描，并使用Imaris5－0－1w軟件進行了三維圖象的構建。2．2 主要三維形態特征 蟲體呈蠕蟲狀，半透明，左右對稱，腹面扁平，背面隆起，長約0．25 m，寬約0．05 mm（圖2），厚約0．02 mm（圖5、6），分顎體、足體和末體三部分（圖2）。顎體扁平，呈對稱五邊形，（圖3、4、5），前端略窄（圖5），位于軀體最前端，伸出的一對突出物，是蟲體的基內葉（basendite），顎體背面前端有一對呈雙葉形短鉚狀的背基刺（supraeoxals spine），以柄著生于基部的陷窩內，推測為一種感覺器官，它對蠕形螨的種類鑒別上有一定意義。第一對足體中部見馬蹄形咽泡（pharyngeal bul b），為分類的特征型結構（圖4）。顎體背面的中部有一針狀的錐狀突（圖5），向前伸出，其前端被顎體腹面的口下板延伸的膜狀結構所包繞，形成短喙狀。顎體背面中部見一對對稱紅染的結構為“眼點”（eyespot），推測為感覺乳突，主要感受溫度和光的刺激（圖3）。自足體起，至第3對足蟲體厚度開始逐漸達到至最厚（圖5），足4對，粗短呈芽突狀，足基節與軀體愈合成基節板，單個足呈圓錐形，套筒狀，結構相似，每足分4節，粗壯（圖3、4）。陰門在第四對足基節片之間的后方，為一圓形開口（圖2、4、6）。毛囊螨末體細長如指狀，約占蟲體全長的3／4，尾部鈍圓，體表覆有明顯環形橫紋，似“同心圓”樣，突出體表，未見排泄孔道圖（圖2）。

特別是此次見到毛囊螨的上消化道，染色后呈紅色，從鄂體最前端中央出現一根管道狀結構，到鄂體中部開始分為左右兩支，并延伸到第一對足中部，呈現倒置“Y”字形，推測為染料從毛囊螨“口前腔”浸入消化道所至（圖3）。

圖2 毛囊蠕形螨全蟲形態Fig．2 Three－di mensional reconstr uction of DF

3 討 論

激光掃描共聚焦顯微鏡是目前生物醫學領域中最先進的熒光成像和細胞分析工具之一。可對標本各深度層面的信息進行三維重建，從而得到表面及內部結構都非常清晰的三維圖像。異硫氰酸（fl uorescein isot hiocyanate，FITC）是目前應用最廣泛的熒光素，其有兩種異構體，其中異構體Ⅰ型在效率、穩定性與蛋白質結合力等方面都更優良。碘化丙啶（pr opidine iodide，PI）是一種標記細胞核的核酸染料，它是一種靈敏的細胞化學熒光探針，能夠透過細胞膜而使細胞核紅染［10］。將毛囊螨用FITC初染，再用PI復染后置于激光共聚焦顯微鏡下觀察：蟲體與兩種熒光染料結合充分，蟲體蛋白與FITC結合后在激發光束作用下發出綠色熒光，蟲體細胞核與PI結合后發出紅色熒光。將所獲連續光學切片用Imaris5－0－1 w軟件進行三維重建，可在三維空間中隨意拖動蟲體各角度觀測其結構。

本研究旨在通過三維形態的研究探討蟲體各結構的功能。蟲體圖像十分清晰，色彩鮮明，特別是“咽泡”“眼點”“基節片”、“足”和“陰門”等結構。研究發現，顎體呈“對稱五邊形”（圖3），與以往描述的呈“不規則四邊形”或“梯形”略有不同，顎體基部尖細，此特點利于的擺動。同時可見蟲體顎體背面中間有左右對稱排列的一對類似“眼睛”的結構，突出于蟲體體表，以往資料極少有提及也未詳細描述過，推測該結構為蟲體的一種感覺器官，主要感受溫度和光的刺激，也可能是原生動物和低等無脊椎動物的小形而構造簡單的視覺器官，且稱“眼點”（eyespot）或感覺乳突。Desch（1970）［12］曾通過光鏡和電鏡研究發現：毛囊螨口前腔底部后方有一短小食管，并從口前腔底部開始彎曲向下通至杯形的“咽泵”，食管腔形狀可隨進食時壓力變化而發生改變，直徑僅一個微米，認為蠕形螨進食的是液體食物。由此，推測見到的倒置的“Y”字形的結構應該為攝食通道，應為“口前腔”經“食管”到“咽泵”部分。本實驗中清晰見到陰門呈“近圓形”，與李朝品（2006）［11］指出陰門為一“狹長縱裂狀開口”略有不同，我們也曾經觀察到陰門呈“狹長縱裂狀開口”和“近圓形”的情況，這可能是雌性生殖器的個體形態差異或是其在繁殖期及交配期形態發生改變。

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