廣西家畜布魯氏菌病的監測分析＊

李 軍，陳澤祥，楊 威，謝永平，李常挺，傅啟寬，駱永泉，李常春，許力干，趙 武

家畜布魯氏菌病（Br ucellosis）是由布魯氏菌（Br ucell a）引起的一種人獸共患傳染病，在全世界廣泛分布，其主要癥狀表現為生殖器官和胎膜發炎、流產、不育及各種組織的局部病灶［1－2］。豬、牛、羊是布魯氏菌的主要宿主，病菌通過流產胎兒、胎衣、羊水、子宮和陰道分泌物、精液、乳汁等排出體外，傳染其它家畜和人類，給人類健康和畜牧業發展帶來嚴重危害，世界動物衛生組織和我國農業部將其列為二類傳染病。

廣西在1952年開始有豬布魯氏菌病的流行和傳播，由于未采取有力防治措施，疫情擴散較快，至1961年疫情擴大到16個縣（市）。1981年對廣西布魯氏菌病疫情普查顯示，在當時行政劃分的86個縣（市）中，有畜間疫情的縣（市）為53個，有人間疫情的縣（市）為47個。1982年至1985年，畜間平均陽性率為4．98%，人間發病人數為463人［3－4］。

廣西于1980年開展家畜布魯氏菌病的防治工作，到2007年全自治區14個市的家畜布魯氏菌病防治效果達到了國家農業部頒布的穩定控制標準并通過驗收，所有家畜不再進行疫苗免疫［5］。

近幾年來隨著社會和經濟的快速發展，廣西牛、羊的飼養量日益增多，家畜的盲目引種和無序流動也日漸頻繁，導致家畜布魯氏菌病疫情隨時有反彈的可能。為此，2009－2011年對廣西14個市的家畜開展布魯氏菌病的監測工作，以便及時掌握疫情動態，防止和控制布魯氏菌病的發生和傳播，保護人畜健康。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 主要試劑和儀器 布魯氏菌虎紅凝集抗原和凝集試管抗原購自中國獸藥監察所；布魯氏菌液體培養基購自美國BD公司、胰蛋白示購自英國Oxoid公司、馬血清購自美國Ther mo公司；細菌基因組DNA提取試劑盒和DNA膠回收試劑盒購于天根生化科技（北京）有限公司。PCR Taq Mix、DNA Mar ker 2購自廣東東盛生物科技有限公司；細菌微量生化反應管購自杭州天和微生物試劑有限公司；其它試劑為國產分析純試劑。PCR儀購自日本Ta Ka Ra公司；凝膠成像系統購自美國Alpha Innotech公司。

1．1．2 被檢血清 2009－2011年對廣西南寧、桂林、柳州、北海、欽州、防城港市、玉林、百色、河池、賀州、貴港、崇左、來賓和梧州14個市35個縣（區）內的規模化養殖場、養殖小區和農村散養戶按比例進行家畜血清抽檢，著重對老疫區和新引進家畜的檢測，共采集家畜血清16 143份，其中豬血清10 123份、牛血清4 767份、羊血清1 253份。

1．1．3 被檢病料 采集自廣西14個市的395份豬、588份牛、87份羊的脾、胎衣、流產胎兒以及布魯氏菌試管凝集試驗抗體陽性家畜的內臟、子宮或睪丸。采集病料裝入密封袋后立即冷藏送檢；不能即送的，置－20℃冷凍后送檢。

1．2 方法

1．2．1 檢測方法和判斷標準 按照國家標準《動物布魯氏菌病診斷技術GB／T18646－2002》進行。采用虎紅平板凝集試驗進行血清樣本初篩，陽性或疑似陽性的血清樣本再用試管凝集方法進行確認。對試管凝集方法確認的抗體陽性家畜進行撲殺，采集病料進行布魯氏菌分離。

1．2．2 布魯氏菌分離和鑒定 將采集的家畜胎衣、流產胎兒以及布魯氏菌試管凝集試驗抗體陽性家畜的內臟、子宮或睪丸用無菌生理鹽水清洗后，在無菌條件下將流產胎兒的肝、脾、腎、淋巴結以及布魯氏菌試管凝集試驗抗體陽性家畜的內臟、子宮或睪丸、胎衣接種在含5%馬血清的胰蛋白示瓊脂培養基（胰蛋白示20 g，葡萄糖1 g，氯化鈉5 g，馬血清50 m L，瓊脂20 g，水1 000 m L）中，置37℃、5%CO2培養箱中連續培養觀察7 d。應用細菌基因組DNA提取試劑盒提取培養基上濕潤、光滑、圓形、革蘭氏染色為陰性小桿菌的細菌基因組DNA，按陳澤祥等建立的PCR檢測方法對細菌進行布魯氏菌的PCR鑒定［6］。按伯杰細菌鑒定手冊（8版）進行布魯氏菌的生化特性鑒定［7］。按鐘旗等建立的方法進行布魯氏菌種型的PCR鑒定［8］，將PCR產物送上海英駿生物技術有限公司測序。

1．2．3 布魯氏菌毒力基因Vir B8的擴增和序列比較 應用鐘旗等建立的方法對分離到的布魯氏菌進行毒力基因Vir B8的PCR擴增［9］。利用DNA膠回收試劑盒回收PCR擴增產物，回收純化后與p MD－18T載體連接，轉化至大腸桿菌DH5α，用質粒小量抽提試劑盒抽提質粒，經雙酶切和PCR鑒定后，將陽性重組質粒送上海英駿生物技術有限公司測序。將測序序列與Gen Bank中登錄的各布魯氏菌種型的Vir B8基因序列進行比較（表1）。

2 結 果

2．1 血清檢測結果 應用虎紅平板凝集和試管凝集方法對2009－2011年采集自廣西14個市的10 123份豬血清、4 767份牛血清和1 253份羊血清進行布魯氏菌病抗體檢測。在2009年有1頭種公豬，2010年有1頭牛和8頭山羊被檢出為布魯氏菌抗體陽性，抗體陽性家畜均來自農村散養戶。具體檢測結果見表2。

2．2 布魯氏菌的分離和鑒定 對采集的395份豬、588份牛、87份羊的脾、胎衣、流產胎兒以及10份布魯氏菌試管凝集試驗抗體陽性家畜的內臟進行布魯氏菌分離和鑒定。經布魯氏菌PCR鑒定有1株從布魯氏菌試管凝集試驗抗體陽性羊分離的細菌被鑒定為布魯氏菌（圖1）。

表1 用于序列比較的菌株信息Tab．1 Bacterial strains infor mation for sequences comparison in this study

圖1 布魯氏菌PCR鑒定結果M．DNA分子質量標準2；1．羊種布魯氏菌5號疫苗；2．1105菌株；3．陰性Fig．1 Brucella identification by PCR M：Mar ker 2；1：Br ucella melitensis vaccine No．5；2：Strain 1105；3：Negative control

表2 2009－2011年廣西家畜布魯氏菌病血清檢測結果Tab．2 Serological test of livestock br ucellosis in Guangxi during 2009－2011

分離的布魯氏菌生化特性結果顯示，該菌能在流堇培養基（1∶5萬）和堿性復紅培養基（1∶5萬）上生長；不產生H2S；不利用L－阿拉伯糖、D－核糖；利用葡萄糖、木糖、半乳糖和赤蘚醇，其生化特性符合羊種布魯氏菌（B．melitensis）的生化特性。

利用A MOS－PCR對分離的布魯氏菌進行種型鑒定，PCR電泳結果顯示在731 bp處出現擴增條帶（圖2）。將PCR產物送上海英駿生物技術有限公司測序，測序結果表明為羊種布魯氏菌，將此菌命名為1105。

2．3 布魯氏菌毒力基因Vir B8的擴增和序列比較

按鐘旗等建立的方法對布魯氏菌1105株提取的基因組DNA進行Vir B8基因的PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳結果顯示獲得720 bp的目的片段（圖3）。

對目的片段進行回收、克隆和測序。將測序獲得的核苷酸序列與參考序列進行比較，1105與羊種布魯氏菌16 M強毒株和羊種布魯氏菌5號疫苗（M5）株的同源性為100%；與其它種布魯氏菌的同源性在99．7%～99．9%之間（圖4）。羊種布魯氏菌

圖2 羊種布魯氏菌PCR鑒定結果M．DNA分子質量標準2；1．陰性；2．羊種布魯氏菌5號疫苗；3．1105菌株Fig．2 Brucella melitensis identification by PCR M：Mar ker 2；1：Negative control；2：Br ucell a melitensis vaccine No．5；3：Strain 1105

Vir B8核苷酸序列與其它種布魯氏菌核苷酸序列的差異是在第576位核苷酸處有一個變異（C→T），但是這一變異屬于同義突變，并未導致編碼氨基酸的改變。

3 討 論

廣西14個市2009－2011年的家畜布魯氏菌病監測結果表明近3年廣西家畜布魯氏菌病血清陽性率均在0．2%以下，仍然在穩定控制標準要求內。廣西家畜布魯氏菌病防治取得顯著效果，主要是得到各級政府主管部門的重視和大力支持，將家畜布魯氏菌病防治工作納入工作范圍，做到家畜布魯氏菌病防治措施層層落實，從上至下都有專人抓管；防治經費也年年落實，使基層工作人員開展防治工作獲得一定的經費補助，被撲殺病畜的畜主也得到一定的經濟補償。

2000年以前，因經濟條件和養殖模式限制，廣西家畜養殖以養豬為主，牛和羊的飼養量較少，家畜布魯氏菌病主要是在豬流行，以豬種布魯氏菌生物3型常見，牛和羊基本無疫情［3，10］。2000年以后，政府大力支持發展養殖業，廣西的畜牧業得到快速發展，不少農戶將牛、羊養殖作為致富手段，但是他們對《中華人民共和國動物防疫法》和《種畜禽管理條例》缺乏了解，沒有申報就盲目私自從外省購買家畜，更未進行布魯氏菌病的檢疫。2002年牛種布魯氏菌病疫情和2004年羊種布魯氏菌病疫情就是通過無序引種的方式引入廣西［11－12］。2010年檢出的9例布魯氏菌病抗體陽性家畜也是畜主未經畜牧行政主管部門許可，就私自從外省引回當地。在監測中，我們還發現農戶引種渠道混亂，從多個地方引種并群的現象非常普遍，造成病源追溯的困難。因此，應加強對廣大農戶宣傳家畜布魯氏菌病防治知識，增強農戶的風險防范意識。同時各縣、市動物防疫機構應更加重視對動物引種的管理和動物流通環節的檢疫，指導農戶合法地從家畜布魯氏菌病穩定控制地區進行引種。引種落地后對家畜進行1個月的隔離檢疫，檢測合格后方可解除隔離。

2009年檢出的1例布魯氏菌病抗體陽性豬來自家畜布魯氏菌病老疫區，目前廣西部分家畜布魯氏菌病老疫區仍存在防疫條件差，疫源未能徹底清除的問題；同時一些鄉鎮或村級獸醫防治人員對家畜布魯氏菌病需要長期和艱苦的工作才能控制的形勢認識不足，個別人員沒有如實匯報種用家畜來源和養殖信息，或是沒能及時完成采樣檢測任務等，防治工作存在應付和被動現象。因此，應定期在各縣、市舉辦家畜布魯氏菌病防治學習班，對基層獸醫防治人員進行業務培訓，提高他們的防治水平。

繼續在廣西14個市實施家畜布魯氏菌病的監測工作，著重對老疫區的豬以及各縣、市新引進牛、羊的檢疫工作，準確掌握疫情信息。根據農村散養地區豬布魯氏菌病的主要傳播途徑為患病公豬這一特點，在農村散養地區推廣普及人工授精技術，提高配種范圍和配種率，切斷豬布魯氏菌病的傳播途徑。

布魯氏菌IV分泌系統是布魯氏菌在細胞內繁殖和形成持續性感染所必需的一個毒力因子，它由Vir B1－Vir B12共12個蛋白組成［13］。Vir B8是布魯氏菌IV型分泌系統的一個關鍵因子，屬于早期分泌蛋白，在抵抗細胞吞噬和細胞內運輸中起主要作用。研究證實Vir B8基因缺失的布魯氏菌變異株毒力較親本菌株弱，感染巨噬細胞的能力顯著降低［14－16］。我們對分離的羊種布魯氏菌 1105進行Vir B8基因克隆和測序，序列比較顯示Vir B8基因在布魯氏菌種型間高度保守。鑒于Vir B8基因與細菌的侵襲力密切相關且在布魯氏菌種型間的高度保守，因此，對Vir B8基因的深入研究將為布魯氏菌疫苗的研制、早期診斷試劑的開發提供線索。

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