致病菌碳源代謝與毒力調控的關聯性＊

周妍妍，闞 飆

在自然環境中，細菌需要應對生長環境（溫度、鹽濃度、氧氣、營養素等）的不斷變化。細菌發展了一些機制以適應這些環境的變化。其中，對可用碳源的適應性機制是其中的重要方面。碳源是細菌對復雜環境作出適應反應的信號之一，某種特定碳源的出現也許使細菌感受到正處于感染相關的機體組織或細胞中，從而促使毒力基因表達。本文就致病菌碳源代謝與毒力調控的關聯性進行綜述。

1 細菌碳源代謝機制

細菌對可用碳源的適應性機制包括：當特定碳源存在時誘導對該碳源的跨膜轉運并加以利用，主要通過碳源磷酸轉移酶系統（carbohydrate phosphotransferase system，PTS）攝取，也可以經ABC轉運 蛋 白 （ATP－binding cassette transporters）和GPH 轉 運 蛋 白 （galactoside－pentose hexuronide translocators）進行碳源的跨膜轉運；若同時存在幾種碳源，細菌會優先利用最有效的碳源并抑制對其他碳源利用，即碳源降解物阻遏（carbon catabolite repression，CCR）。在腸道菌和革蘭陽性菌中，PTS介導CCR作用。PTS［1］是很重要的感應并控制碳源代謝的系統，能攝取并磷酸化多達20種PTS糖及其衍生物，其以磷酸烯醇丙酮酸（PEP）作為磷酸基團的供體，EI發生自磷酸化后將磷酸基團轉移給HPr，HPr又將磷酸基團傳遞給EIIA。除果糖PTS系統外，共用磷酸基團轉運蛋白EI和HPr向特異EII蛋白傳遞磷酸基團。已知的EII蛋白由三個以上的結構和功能域組成，通常稱為EIIA、EIIB、EIIC。EIIA、EIIB成分作為HPr與底物之間的磷酸傳遞體，而EIIC成分通常包含多個（螺旋結構，嵌于膜內形成疏水通道。通常，EI、HPr、EIIA和甘露糖的EIIB的組氨酸殘基被磷酸化，而其他EIIB是半胱氨酸殘基磷酸化。革蘭陽性菌和一些革蘭陰性菌的HPr色氨酸殘基能被磷酸化。PTS蛋白的磷酸化狀態具有很重要的調節功能。

在腸道菌里，CCR主要是通過去磷酸化的EIIAGlc（Glc，葡萄糖glucose）［2］介導。當有效的碳源存在時，去磷酸化的EIIAGlc抑制乳糖、蜜二糖通透酶，麥芽糖運載蛋白MalK和甘油激酶的活性，從而影響這些糖醇的吸收利用，也即誘導排斥（Inducer exclusion）。

革蘭陽性菌的CCR主要通過HPr介導。革蘭陽性菌的六聚體酶 HprK／P （HPr kinase／P－Ser－HPr phosphorylase）介導HPr的絲氨酸殘基磷酸化或去磷酸化。當高效源如葡萄糖、果糖被攝取時，非PEP和EI的有效底物的P－Ser－HPr含量升高，抑制了其它碳源通過PTS的攝取。當只有低效碳源存在時，菌內無機磷酸鹽含量升高，HPr主要以PEP和EI的有效底物P～His－HPr形式存在。這種HPr的不同形式，直接或間接與CCR有關［3］。其次，P－Ser－HPr能與 CcpA（catabolite control protein A）形成復合物結合到cre（catabolite response elements）上，從而介導碳源降解物激活（carbon catabolite activation，CCA）或CCR。在枯草桿菌和其他革蘭陽性菌中，大約10%的基因受CcpA／PSer－HPr調節。此外，P－Ser－HPr還介導非依賴CcpA的CCR機制。還有，P～His－HPr及P～EII還分別正負調控一些含磷酸化作用位點PRD（PTS regulation domain）的反終止因子和轉錄激活子，從而介導非依賴CcpA的CCR機制［4］。

2 硬壁菌門碳源代謝與毒力的相關關系

在化膿鏈球菌中，M蛋白是其主要的致病因子，存在于細胞壁，由emm編碼，起抗吞噬作用并促進對組織和胞外基質的粘附。當存在包括葡萄糖等幾類碳源時，會激發M蛋白的表達。基因emm的上游是基因mga（multiple gene regulator），Mga不僅調控自身的表達和M蛋白，還調控有關細胞粘附、侵襲和免疫逃逸的蛋白［5］。目前已知CcpA能結合在Mga啟動子區cre從而介導CCA，通過啟動子P1正調控 mga 轉錄［6］，P－Ser－Hpr很有可能與 CcpA形成復合物參與了這個過程。CcpA正調控mga，與葡萄糖能激發M蛋白合成的現象是一致的［3］。在不同的生長階段Mga的表達不一樣，因此P1會在細菌生長的哪一階段起作用還未知。化膿鏈球菌的CcpA除了可能在某一進程通過Mga調控M蛋白，還介導了對鏈球菌溶血素S（streptolysin S，SLS）的抑制［7］。并且，通過轉錄組比較，發現CcpA與很多其他毒力因子也相關［8］。除了CcpA，與乳糖PTS組分有關的醛縮酶LacD．1能強烈抑制感染相關基因speB的表達［9］。另外，麥芽糖／麥芽三糖PTS對鏈球菌在唾液里的生長及在口咽部的定殖起到很重要的作用［10］。最后，在化膿鏈球菌中，編碼 MsmR（multiple sugar metabolism regulators）的基因位于一個含毒力基因的區域，而其中的一些毒力基因確實也是受MsmR控制［11］。

在單增李斯特菌中，Crp／Fnr家族的轉錄激活子PrfA能夠調節多個毒力基因如plcA、plcB、hly、actA、mpl、uhpT 和inlC 的表達［12］，而葡萄糖、果糖、麥芽糖、纖維二糖等能被高效利用的碳源會抑制PrfA的表達。PrfA的表達雖然與CcpA無關，但用枯草桿菌作為異源系統對PrfA的研究顯示PSer－HPr的增加能減低PrfA的活性［13］。同時，EI、HPr的失活也會極大削弱PrfA的活性［13］，可見，PrfA的活性有賴于PTS磷酸級聯的完整。其次，反應調節蛋白基因ResD的失活會使高效碳源不再抑制一些PrfA調節的毒力基因表達［14］。另外，P～His－HPr磷酸化甘油激酶能夠大大增加甘油激酶的活性，而甘油的利用能增加PrfA調節基因的表達［15］，由此可見PTS蛋白與PrfA的聯系。

還有很多其他革蘭陽性菌的碳源代謝和毒力有聯系。產氣莢膜梭菌的CcpA影響膠原蛋白酶、孢子生成效率，并與腸毒素基因cpe及莢膜合成相關，且能抑制Ⅳ型菌毛相關的滑移［16］。肺炎鏈球菌的CcpA與莢膜多糖合成有關，CcpA的失活能使肺炎鏈球菌毒力的下降，并且CcpA與其在鼻咽部的定殖、肺部的繁殖有關［17］。β－半乳糖苷酶BgaA的生成對肺炎鏈球菌的粘附和在鼻咽部的定殖很重要，而其受CcpA調控［18］。最后，小鼠肺炎鏈球菌感染模型的肺部組織能誘導乳糖／纖維二糖PTS和甘露糖 PTS特異性表達［19］。

3 含HprK／P的變形菌碳源代謝與毒力的相關關系

除了革蘭陽性菌里有HprK／P，革蘭陰性菌里的α、β、γ－變形菌也有 HprK／P［20］。這些革蘭陰性菌里有EI、HPr和一兩個EIIA，缺乏CcpA、EIIB和EIIC。

在α－變形菌中，hprK 通常鄰近ptsH（編碼HPr）或編碼EIIA的基因，且和毒力或共生相關調節基因在同一操縱子里［3］，這種基因位置的鄰近可能預示著毒力與碳源代謝的關系。根瘤土壤桿菌中，chvI－chvG 基因 編碼EnvZ／OmpR 雙組分系統（two－component system），其缺失后能導致根瘤菌毒力消失［21］，而根瘤菌的hprK 和chvI－chvG 就在同一個操縱子里。其次，除了hprK基因可能和根瘤菌致病相關，乙酰丁香酮等可通過雙組分信號傳導系統VirA／VirG誘導一系列毒力基因vir的表達。此外，可能屬ABC碳源轉運系統的葡萄糖／半乳糖結合蛋白ChvE，能通過介導葡萄糖、半乳糖、巖藻糖、阿拉伯糖、木糖等碳源的趨化和攝取來誘導毒力基因vir的表達，并在細菌趨化性也起作用［22］。牛種布魯氏桿菌中，BvrR／BvrS雙組分系統可能通過與PTS組分相互作用，直接間接影響布魯桿菌進入胞內微環境的過程［23］。而ptsN和ptsH 的缺失也導致了布魯桿菌毒力的減弱［24］，如pts相關缺失株顯示毒力相關蛋白VirB的生成明顯減少［25］。

β－變形菌中，腦膜炎奈瑟氏菌的hprK與果糖EIIA編碼基因及yhbJ位于同一操縱子里，而hprK的缺失能導致腦膜炎奈瑟菌粘附細胞的能力明顯下降［20］。這種現象的出現可能是因為基因yhbJ在腸桿菌中屬于rpoN 操縱子的一部分，能作用于Ⅳ型菌毛合成基因pilE 的－12、－24啟動子區［26］。

γ－變形菌中，嗜肺軍團菌和銅綠假單胞菌的ptsP缺失株毒力大部分消失，在動物模型和細胞里生長緩慢，而相應的回補株能夠使毒力回復，顯示這兩類菌的毒力與 PTS相關［27－28］。

4 不含HprK／P的變形菌碳源代謝與毒力的相關關系

部分變形桿菌不含HprK／P，其毒力基因的表達通過其他一些碳源代謝機制調控。鼠傷寒沙門氏菌中，去磷酸化EIIBGlc通過控制作用于基因hilE啟動子區的轉錄調節因子 Mlc，抑制hilE從而促進SPI－1（毒力島I）的基因表達［29］。而基因ptsI（EI編碼基因）、cya（腺苷酸環化酶，催化 ATP生成cAMP）、crp（CRP編碼基因）的失活均能導致鼠傷寒沙門氏菌在動物模型里毒力的減弱［30］，其中，ptsI的失活影響激活cya表達的P～EIIAGlc生成，因此推斷ptsI可能也是通過CRP－cAMP影響細菌毒力。當鼠傷寒沙門氏菌進入腸道，短鏈脂肪酸能通過BarA－SirA雙組分系統誘導SPI－1和SPI－2核心轉錄激活蛋白hilA的表達［31］。在霍亂弧菌中，CRP－cAMP復合物影響其毒力的表達、密度感應、動力和小腸定殖［32］，其中一部分可能是由CRP－cAMP對核心調節蛋白HapR的CCR作用所致。其次，霍亂弧菌的EI還調節生物膜相關的生長［33］。創傷弧菌的甘露醇代謝與其毒力相關，具體機制未知［34］。伴放線菌聚集桿菌，能致嚴重的牙周炎，它的白細胞毒素也受CRP－cAMP調節［35］。火疫歐文氏桿菌能使薔薇科植物患火燒病，而此菌對植物感染的前提是PTS對蔗糖的轉運［36］。在假結核耶爾森氏菌里，Csr（carbon storage regulator system）通過RovM調節其毒力調節蛋白RovA，其中，csrC和csrB編碼的sRNAs抑制rovA表達，而CsrA抑制RovA的合成［37］。福氏志賀菌的RNA結合蛋白CsrA能促進其糖酵解，而磷酸果糖激酶Pfk1（由pfkA編碼）是其糖酵解途徑的一個關鍵酶。csrA、pfkA的失活均能使毒力蛋白IpaB、IpaC產量降低，同時，毒力蛋白Ipa的正調控蛋白編碼基因virF、virB 轉錄水平也降低［38］。

5 放線菌門碳源代謝與毒力的相關關系

放線菌門的結核分枝桿菌是很重要的人類致病菌。在小鼠模型里，結核分枝桿菌在感染的早期需要ABC轉運系統對糖醇的轉運［39］，后期依賴宿主的脂肪酸作為碳源［40］。結核分枝桿菌編碼ABC轉運脂肪系統的mce操縱子在體外培養狀態表達受抑制［41］，mce操縱子被敲除的結核分枝桿菌在小鼠體內的毒力大大降低［42］，這些預示著碳源代謝與結核分枝桿菌致病有關聯。其次，結核分枝桿菌可以在吞噬細胞的吞噬小體里生存，但在吞噬小體里并沒有宿主碳源，不過其中有結核分枝桿菌合成分枝菌酸時分泌出胞外的海藻糖，結核分枝桿菌可以利用 ABC 轉運系統 LpqY－SugA－SugB－SugC 來逆向轉運海藻糖進胞內作為能量來源，而對海藻糖轉運的干擾會削弱其毒力［43］。另外，有毒力的牛型結核分枝桿菌，在體外連續傳代后，其CRP（Rv3676編碼）發生位點突變而失活，這可能致使CRP控制的宿主體內生存相關基因不能表達，使毒力減弱但仍保持免疫原性，從而獲得卡介苗（BCG）［44］。

5 小 結

越來越多的證據表明HprK／P及PTS蛋白是碳源代謝與毒力相關連的紐帶，革蘭陽性菌里的單增李斯特菌和鏈球菌的P－Ser－Hpr調節毒力基因表達的分子機制比較明確，而革蘭陰性菌里HprK／P和PTS蛋白與細菌毒力相關的跡象也越來越多。不過，P－Ser－HPr調控PrfA是在枯草桿菌異源系統里證實的，需要進一步在單增李斯特菌里驗證，而葡萄糖對mga的影響也需要在鏈球菌里進一步確定。除了HprK／P和PTS蛋白，CRP－cAMP也是調節毒力的關鍵因素，ABC轉運系統和雙組分系統也可能在碳源代謝與毒力之間起橋梁作用，還有在鼠傷寒沙門氏菌中，Mlc調節SPI－1的途徑也已比較明朗。總之，從碳源代謝在細胞代謝中的重要性，不難理解其與細菌毒力的聯系，只是其中的機制還不是很清楚，如CRP－cAMP究竟是怎樣調控毒力相關基因表達的，鼠傷寒沙門氏菌里的ptsI是不是通過CRP－cAMP影響毒力表達，磷酸化／非磷酸化蛋白如何與轉錄調節蛋白相互作用等。特別是對于胞內菌如單增李斯特菌、福氏志賀菌、鼠傷寒沙門氏菌和結核分枝桿菌，碳源代謝在體內是不是確實影響毒力基因表達，如何影響，都需要細胞、組織培養及動物模型這些體內實驗來進一步確證和積累數據。

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