博爾納病毒的研究進展

金興振（綜述），徐 平（審校）

博爾納病病毒（Borna disease virus，BDV）最早發現是在18世紀末德國的南部出現了少量的散發感染病例，但是在當時還沒有對它正式的命名。1894－1896年在Saxony州Borna鎮的馬群中曾經暴發流行一種腦炎，當時德國正處于威廉二世皇帝統治的時期，積極地準備對外擴張，出現這一事件必然引起了他們的高度重視，博爾納病（Borna disease，BD）因此而得名并首次為人們所認識［1］。

直到20世紀初，Zwick最早在被病毒感染的馬腦組織中分離鑒定了BDV病毒株，之后Bode在精神疾病患者外周血淋巴細胞中分離了BDV的V株，其后世界各地在患病動物和臨床患者中不斷分離到BDV的病毒株［2］。最初認為BDV感染只是分布在德國南部、瑞士、奧地利以及列支敦士頓等萊茵河上游地區的散發感染［3］。但是后來在另外的7個國家，包括人類在內的大多數恒溫動物中分離或者檢測出病毒，人們才逐漸意識到BDV有著更為廣闊的感染區域。

BDV是一種非節段性的單股負鏈RNA病毒（Nonsegmented negative－strand RNA virus，NNR病毒），為單股負鏈病毒目中的一個新的家族Borna病毒科的典型代表［4］。BDV具有嚴格嗜神經性，并可長期寄居在神經系統內而不被機體免疫系統清除，明確其致病機制對許多神經系統的疾病及病毒持續感染的研究具有重要意義［5］。BDV基因組長8．9kb，具有6個可讀框，分別編碼磷蛋白（Phosphoprotein，P）、核蛋白（Nucleoprotein，N）、糖蛋白（Glycoprotein，G）、基質蛋白（Matrix protein，M）、X蛋白（X）和RNA依賴的 RNA 聚合酶（L）。BDV在分子生物學方面有幾個特征：（1）定位于核內的轉錄和復制；（2）重疊的可讀框與轉錄單位；（3）亞基因組RNA轉錄后的修飾；（4）在不同動物種屬和組織培養系統中編碼序列的顯著保守性。

1 BDV流行病學調查

BDV是一種高度嗜神經病毒。原本是存在于德國東南部的馬和羊體內的一種自然病原體，但是從目前掌握的資料來看，它已經感染了許多物種，從鳥類到世界各地的靈長類動物［6］，不僅可以引起馬、羊等家畜的自然感染，還可以引起嚙齒類動物感染，甚至是除人以外的靈長類動物均易受到BDV的感染。馬和羊是BDV主要的感染動物，已經認定為主要的自然宿主，國內外多篇報道均有充分證實，馬的BDV特異性抗體在各大洲也得到證實。此外，國外還報道了BD自然病例零星發生于如除山羊以外的其他家養動物，例如Hodgson等人發現澳大利亞貓的自然感染證據［7］。不僅是家養動物有自然感染的報告，野外生存動物感染病例也有報道，日本科學家通過對野外生存的浣熊采用RT－PCR的方法研究，得出結論：一個遺傳度很高的BDV序列來源于浣熊的血清［8］。除此之外，BD還在羊駝身上首次得到確診［9］。自然感染的雙色白齒鼩組織中BDV抗原的RNA的分布也支持它們作為宿主物種［10］。野生的鳥類也可能作為亞臨床感染的攜帶者，這或許可以解釋在某些年份，與其他疾病相比，有些疾病的季節性（春季和夏初）發病率較高的原因。但是確切的流行病學證據還沒有完全掌握［11］。

盡管針對動物的報道不斷更新，但是目前的數據顯示，BDV在人類神經精神疾病的發病機制一直沒有明確，是否存在持續感染或者機體清除病毒感染也同樣沒有定論。有些研究證實，在某些精神疾病病人的血清中存在BDV特異性抗體，但是同樣也有些大樣本的研究卻沒有發現抗體和病毒存在的證據。例如，Heinrich A等人通過對94例精神病患者長達20年的BDV特異性抗體滴度檢測并聯系臨床情況分析得出，人類存在慢性BDV感染［12］，而Na K S等檢測了198例患有精神疾病的病人血樣，均未檢到BDV或抗體［13］。另外，一項捷克共和國的前瞻性研究對酒精和藥物依賴病人以及健康獻血者的血清循環免疫復合物進行分析表明：沒有發現成癮患者較正常對照組有明顯增高的BDV循環免疫復合物水平，高水平的BDV免疫復合物在低水平γ—谷氨酰胺轉氨酶和低年齡的患者中被檢測到［14］。

在最近的研究中，不斷地有報道在神經精神疾病如精神分裂癥、自閉癥、慢性疲勞綜合征和慢性抑郁癥患者中檢測到BDV，日本和美國科學家研究發現，人類和其他哺乳動物的一部分DNA最早來自于一種RNA病毒——博爾納病毒（Borna virus）。研究人員認為，這種來源于病毒的DNA可能是引起基因突變的原因之一，也可能導致如精神分裂癥之類的精神疾病。病毒序列同化到宿主細胞基因組中的過程稱為內生化（endogenization）。當這種病毒的DNA整合到生殖細胞的染色體，將會隨生殖細胞傳遞到子代個體中。此前逆轉錄病毒是唯一已知的可在脊椎動物中內生化的病毒。但最新的這項研究發現，非逆轉錄病毒博爾納病毒也可在進化過程中內生化到哺乳動物基因組中［15］。有相關評論也明確指出，BDV在哺乳類動物的基因組，包括人類基因組、非人類靈長類基因組、嚙齒類動物基因組和大象基因組中存在有DNA片段序列，并可遺傳給后代［16］。進一步提示BDV與人類疾病的發病關系密切。

2 BDV的檢測方法

2．1 實時熒光定PCR是一種新近發展出的技術，該技術使用一個雙標記的TaqMan熒光探針，能實時檢測產生的PCR產物。與常規PCR相比，熒光定量PCR技術在敏感性和特異性方面具有以下特點［17］：（1）當熒光信號達到檢測點 Ct值時，PCR 反應體系處于最佳飽和狀態，最能反映起始的模板數，克服了常規PCR平臺效應帶來的誤差。因此，可準確定量待檢模板的拷貝數；（2）閉管檢測，不需PCR產物后處理，有效避免了擴增產物交叉污染引起的假陽性；（3）引物和探針特異地同目的模板結合，相當于PCR技術與寡核苷酸探針雜交技術二者之結合，保障了檢測的特異性。但并沒有在PCR之后單獨做雜交的操作，而是貫穿于整個PCR過程中同時完成的；（4）熒光檢測的靈敏度顯著高于肉眼觀察電泳條帶的靈敏度；（5）操作簡單、方便、安全、快速，整個過程由電腦控制，不存在溴化乙錠和同位素對人體的危害性問題。目前反轉錄后熒光定量PCR已經取代常規PCR來檢測定量血液或組織樣本中的BDV RNA，在不同的患病人群中，檢測陽性率各不相同。成為診斷BDV感染的一種重要方法。

何豐等［18］在牧羊犬外周血和腦組織博爾納病病毒檢測結果的比較研究中使用FQ－nRT－PCR對標本RNA進行BDV p24基因片段檢測。結果發現，100只牧羊犬中，其中有9例腦組織標本是陽性，而同時對應的只有5例外周血標本呈陽性。其余所有牧羊犬的腦組織和外周血標本都為陰性。陽性率分別為9%，5%。

劉建等［19］在博爾納病毒在寧夏的人和動物感染的檢測中研究采用巢式逆轉錄實時熒光定量PCR的方法在60例VE的患者中BDV P24陽性患者3例，陽性檢出率為5%，其中7例患者BDV P40 PCR電泳后與P40標準品相同，片段大小在154bp左右，陽性檢出率5．88%；在VE患者接觸的動物檢測中，發現109頭綿羊P24呈陽性曲線，陽性率15．35%，P40電泳后發現9頭綿羊陽性，陽性檢出率為1．27%。

趙莉等［20］在寧夏綿羊腦組織博爾納病病毒的自然感染狀況的研究中應用FQ－nRT－PCR檢測了寧夏163只綿羊腦組織中的BDV p24基因片段，其陽性率為3．68% （6／163），6例陽性標本同時都檢測到了p40基因片段，說明在綿羊顳葉腦組織中既可檢測到p24基因片段又可檢測到p40基因片段。2．2 免疫印跡法是將病毒的抗原通過電泳分離后電轉到PVDF膜上，與待測樣本的血清（一抗）結合后用標記的抗宿主抗體（二抗）顯色。使用BDV單克隆抗體作為Marker，可以鑒定不同分子量的抗原蛋白。同時使用未感染和已經感染的樣本作為陰性和陽性對照。另外免疫印跡還有費時、昂貴和敏感性與特異性呈反比等特點［21］。

2．3 酶聯免疫吸附試驗（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）方法和免疫熒光不同，其結果的評判多采用機器，故較為客觀。該方法血清學實驗陽性并不一定代表被檢者正存在BDV感染，因為目前的研究成果尚不清楚BDV抗體陽性是代表BDV感染存在還是BDV已被清除。但是采用三聯－ELISA法檢測BDV病毒抗原，使用相同特異BDV參數，可以識別天然抗體，抗原，免疫復合物。具有穩定﹑可信﹑敏感的優點，是唯一檢測感染活化的方法，并可監控治療效果的指標。

另外，蛋白免疫印跡方法的確可以確診許多病毒感染，并且適用于分辨血清中和腦脊液中抗蛋白N和P的抗體。然而，蛋白免疫印跡并不是診斷人類BDV的前沿方法，因為它相對于新一代的用病毒本身的抗體來檢測的ELISAS來講敏感度太低。最近BDV N，P蛋白的抗原決定簇映射實驗的結果表明與檢測病毒自身抗體的ELISA結果一致，并且該結果支持本身的抗原決定簇的構象是有效識別抗BDV抗體的關鍵。

Liv Bode和Hans Ludwig［22］以及他們的實驗組設計的ELISA是基于一種抗體穩定的雙層三明治結構單克隆抗體以用來識別BDV蛋白N（P40）和蛋白P（P24）的抗原決定簇構象—BDV感染中主要起免疫作用的組分。結合在自身BDV抗體上的單克隆抗體由非純化感染的馬的大腦或者持續感染的組織的培養細胞制備而來。目前，之所以選擇該方法是因為它具有較高的敏感度和特異性，并且它將成為檢測該類抗體的金標準。

2．4 病毒分離被公認是檢測病毒的金指標。該方法通常由組織勻漿培養和活體動物培養兩部分組成。依據原始的BDV的濃度，其勻漿培養的陽性結果出現時間從24h到幾個月不等。病毒感染最常使用的和最敏感的細胞是Vero細胞、C6細胞和MDCK細胞，持續的細胞感染過程中沒有細胞病變發生。活體培養最為常用的動物是兔和小鼠。由于BDV感染時病毒量很少，所以使用傳統的病毒分離方法不僅復雜而且敏感性很低［21］。

Sakudo A等［23］改進病毒分離方法，使用陰離子聚合物涂層磁珠，來分離博爾納病病毒，并通過PCR和WB確認獲得成功，這種方法雖然操作復雜，但是可能會提高BDV的檢出率。

2．5 其他檢測方法 截止目前的研究資料，還沒有足夠的證據證明BDV是人類疾病的致病因素，最近對BDV抗體的研究也只是提示感染的標準物，這些抗體的發現不僅是在神經精神疾病，也存在于免疫功能低下的健康個人，因此確定新的特異性感染標志物來解釋這個問題顯得尤為重要，對于人感染BDV的診斷以及對它發病機制的了解來說，在感染過程中表達的蛋白質的檢測已經成為研究的關鍵領域，隨著技術的不斷更新，在神經精神疾病患者外周血單核細胞中檢測BDV抗原抗體和核酸的新方法已經開始應用。這些技術包括血液中的病毒特異性抗體的檢測，循環免疫復合物和循環血漿抗原以及T細胞增殖實驗檢測等等。

德國科學家Heinrich A等［12］在1985－2006年期間對精神分裂癥患者（n＝46）、情感障礙患者（n＝19）、其他精神疾病患者（n＝29）共94例血清陽性病人采用間接免疫熒光法反復監測BDV特異性抗體滴度和臨床情況。該小組對46例患者進行了大于36個月的長期抗體滴度分析，并測定博爾納病毒特異性抗體長期滴度動態。結果顯示有25例病人血清呈持續陽性反映54．3%（25／46）。對精神病患者群體持續陽性血清的長期監測分析，表明人類存在BDV慢性感染的可能。

捷克學者Rackova S［24］對39例在精神科住院的病人進行BDV血漿免疫復合物的檢測，結果顯示在第0d、28d、56d精神疾病患者的BDV－CIC檢出率 分 別 為 66．7% （26／39）；53．9% （14／26）；52．9%（9／17）。健康對照組為22．2% （28／126）。這一結果說明了BDV－CIC在精神病人的檢出率比健康人高（P＝0．001）。而且病情越重的精神疾病患者的BDV－CIC的檢出率越高，提示BDV在體內的復制數量和侵襲程度可能與精神疾病的嚴重程度有關。捷克共和國另外一項針對成癮性病人陽性BDV－CIC的前瞻性研究［14］，采用ELISA方法檢測了酒精和藥物依賴病人以及健康獻血者的血清CIC。結果顯示：陽性BDV－CIC在開始時陽性率為36．5%，8w后陽性率達到42．86%，對照組的陽性率為37．3%，沒有發現成癮性患者比健康獻血者有更高的 BDV－CIC陽性率（P＝0．179），高水平的BDV－CIC可能與低水平GGT以及低年齡有關。

3 BDV的治療

目前尚未制定對BD患者具體的治療方法，但是少數的藥物常被用來進行治療，例如金剛烷胺，就是其中之一，它是一種非競爭性的N－甲基－D型（N－methyl－D－aspirate type）谷氨酸受體拮抗劑，也具備結合活性煙堿乙酰膽堿受體的能力［25］。其機制可能是通過增加合成和釋放多巴胺以及減少神經元攝取來起作用。它也被認為有一定的抗病毒作用，可以干擾宿主細胞病毒基因組的脫殼和釋放。所以，它不僅可以抑制BDV成熟細胞在體外的復制還可以防止幼稚細胞的復制。一項針對急性抑郁癥或者雙相情感障礙患者的臨床實驗證明，金剛烷胺的治療效果顯著，5年的隨訪顯示血漿抗原水平不斷降低［22］。

在動物的預防和控制方面，三環癸胺硫酸鹽，一種抗A型流感病毒活性的藥物，被推薦用于BD病馬的治療。然而，它在BDV感染細胞和感染動物的治療上具有不同的效果。例如Rubin SA等［27］用α－4結合素單克隆抗體治療動物BD，結果在慢性漸近性BD病例中獲得了顯著的臨床效果，CNS中免疫細胞浸潤顯著減少。

4 BDV的展望

BDV是一種無論從基因角度還是從生物學來講相對獨立的病毒，不但能夠感染馬，羊，狗等各種溫血動物，在神經精神疾病患者的血液和腦脊液檢查中均發現BDV感染的證據，說明了BDV也存在感染人類的潛在威脅。盡管BDV在人群中感染和與人類疾病關系密切已經廣泛報道，但是諸如血清學檢查在實驗室間的差異、抗體檢測滴度較低等都需要進一步研究來闡明，而BDV感染人類的病原、途徑和機制也要通過進一步研究來發現。傳統的BDV感染區以外地區的BDV流行病學數據也必須通過標準的檢測手段來補充。

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