人免疫球蛋白G含量檢測方法的研究進(jìn)展

李 虎，臧恒昌，張 惠

(1.山東大學(xué)藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250012;2.山東泰邦生物制品有限公司，山東 泰安 271000;3.國家糖工程技術(shù)研究中心，山東 濟(jì)南 250012)

免疫球蛋白G(immunoglobulin G，IgG)是人體含量最多的免疫球蛋白，占總血清免疫球蛋白的70% ～80%左右，相對分子質(zhì)量為150 kD，是再次抗體應(yīng)答中所產(chǎn)生的主要免疫球蛋白。成人血清中IgG含量約為7.0～16.6 g·L－1，人血清中的IgG主要為單體，包括四個(gè)亞類，其中IgG1占60% ～70%，IgG2占15～20%，IgG3占5% ～10%，IgG4占1～7%，不同亞類其重鏈的抗原性不同。IgG是機(jī)體抗感染免疫的主力抗體，其在體液中含量的高低往往作為慢性感染、慢性肝病、免疫性疾病等疾病的參考值，因此測定人體血清中IgG含量可對許多疾病的早期診斷提供依據(jù)。通過分離純化健康人血漿可得到較純的IgG制劑，如靜注人免疫球蛋白等。靜注人免疫球蛋白在臨床上用于治療多種免疫球蛋白缺乏癥和自身免疫性疾病，如X聯(lián)鎖低免疫球蛋白血癥、川崎病、特發(fā)性血小板減少性紫癜等［1］，準(zhǔn)確測定靜注人免疫球蛋白中IgG的含量對其質(zhì)量控制具有重要意義。目前測定IgG含量的方法有多種，按照其基本原理的不同可大體分為:免疫學(xué)方法、色譜分析法、生物傳感器技術(shù)及共振散射法。本文對各種方法的原理及其特點(diǎn)作以下綜述。

1 免疫學(xué)方法

1.1 免疫擴(kuò)散法 免疫擴(kuò)散法是早期檢測人IgG含量的常用方法，其原理為在一定條件下，人IgG與相應(yīng)的抗體血清在凝膠中產(chǎn)生的沉淀環(huán)的大小與相應(yīng)的抗原含量成正比。一般操作是將抗人IgG血清均勻混合于液態(tài)的瓊脂或瓊脂糖膠內(nèi)，打孔，加樣，37℃孵育24 h，用游標(biāo)卡尺測定擴(kuò)散環(huán)的直徑，代入以不同濃度IgG標(biāo)準(zhǔn)品同法操作構(gòu)建的回歸方程中，計(jì)算出待測樣品的IgG含量。這種方法操作簡便，無需儀器，成本較低，選擇性強(qiáng)，靈敏度較高，檢出量一般為10～20 mg·L－1。但其準(zhǔn)確度受擴(kuò)散環(huán)的清晰度及測量誤差影響較大，實(shí)驗(yàn)時(shí)間長(24 h以上)，影響因素較多。

1.2 免疫比濁法 免疫比濁法于20世紀(jì)70年代由Ritcltic C首次提出，發(fā)展至今已成為臨床檢測人血清IgG的主要方法。其原理為IgG與相應(yīng)的抗體在適宜的液相中特異性結(jié)合，形成可溶性的抗原抗體復(fù)合物，在促聚劑(如聚乙二醇等)的作用下抗原抗體復(fù)合物自溶液中析出，形成微粒，使反應(yīng)液出現(xiàn)濁度。當(dāng)抗體濃度固定時(shí)，反應(yīng)液的濁度隨著檢樣中抗原量的增加而增加，與一系列標(biāo)準(zhǔn)品對照，即可計(jì)算出檢樣中抗原的含量。免疫比濁法按照檢測原理不同可分為以下三種:免疫透射比濁法、免疫散射比濁法和免疫膠乳比濁法。

散射比濁法與透射比濁法比較，兩者檢測結(jié)果的偏差隨樣品IgG濃度的升高而增大。李多孚等［2］利用這兩種方法檢測不同IgG濃度的人血清，發(fā)現(xiàn)當(dāng)IgG濃度高于35 g·L－1時(shí)，相對誤差可達(dá)10%以上。散射比濁法靈敏度和準(zhǔn)確度都要優(yōu)于透射比濁法，但散射比濁法因其所需儀器及試劑價(jià)格較高，使得實(shí)驗(yàn)成本較高;而免疫乳膠比濁法由于使用乳膠顆粒作為載體，增大了濁度粒子體積，所以具有較高的檢測靈敏度，可用于檢測IgG含量較低的樣品。

1.3 紫外－可見分光光度法 紫外－可見分光光度法是《中國藥典》2005年版中檢測靜注人免疫球蛋白類人IgG含量的測定方法，適用于檢測IgG純度較高的樣品。此方法的原理為在適當(dāng)?shù)碾x子強(qiáng)度、溫度、pH條件下，IgG與相應(yīng)的抗體特異性結(jié)合，形成抗原抗體復(fù)合物，根據(jù)供試品溶液在340 nm處的吸光度與同法處理的標(biāo)準(zhǔn)品系列對照，求出其中人IgG的含量［3］。該方法線性關(guān)系較好，穩(wěn)定性與準(zhǔn)確性較高，且操作簡便易行。此法亦可應(yīng)用于其他非人源性IgG的測定，蔣衛(wèi)等［4］利用此方法定量測定凍干的豬血清中IgG含量，取得了良好效果。

1.4 酶聯(lián)免疫吸附法 酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)是免疫反應(yīng)和酶催化顯色反應(yīng)相結(jié)合的一種免疫診斷技術(shù)。基于此技術(shù)制成的ELISA試劑盒被廣泛應(yīng)用于各類臨床免疫學(xué)檢測。ELISA試劑盒是將有免疫活性的抗原或抗體結(jié)合在固體載體上(一般為塑膠孔盤)上，使待測物與之發(fā)生免疫反應(yīng)，配合酶催化的顯色反應(yīng)可顯示目標(biāo)物是否存在，在一定條件下顯色深淺與待測物中抗原或抗體的量成正比。根據(jù)待測樣品與鍵合機(jī)制的不同，ELISA可設(shè)計(jì)出各種不同類型的檢測方式，主要以夾心法(Sandwich)、間接法(Indirect)以及競爭法(Competitive)三種為主。夾心法分別以兩種抗體對樣品中的抗原進(jìn)行兩次特異性識(shí)別，因此選擇性較高，一般應(yīng)用于定量檢測各種蛋白質(zhì)等大分子抗原。間接法一般用于檢測抗體，需要以高純度的抗原來提高選擇性。競爭法是一種較少用到的ELISA檢測方法，一般用于檢測小分子抗原。ELISA試劑盒靈敏度高，選擇性好，使用方便快速，適用于臨床大批量檢測。該方法目前多應(yīng)用于特異性IgG的檢測，以確診相應(yīng)疾病。陳翊［5］等以重組 SARS冠狀病毒結(jié)構(gòu)蛋白作為抗原建立的ELISA檢測方法有較高的特異性和靈敏度，適用于SARS的輔助診斷。

2 色譜分析法

高效親和色譜(high－performance affinity chromatography，HPAC)結(jié)合了高效液相色譜與親和色譜兩種方法的特點(diǎn)，檢測靈敏度有大幅提高，而高度的親和力使得HPAC在所有色譜模式中具有最高的選擇性。HPAC是將可與人IgG特異、可逆結(jié)合的配基鍵合在凝膠載體上制成固定相填于層析柱中，待測物與磷酸鹽緩沖液流過層析柱時(shí)，其中的人IgG與固定相上的配基發(fā)生抗原－抗體結(jié)合反應(yīng)而停留在柱上，其他物質(zhì)則通過色譜柱，然后再用甘氨酸－鹽酸鹽緩沖液作為淋洗液將柱上的人IgG洗脫下來，進(jìn)入紫外檢測器，可測得樣品中人IgG的含量。王淼［6］等用HPAC法測定靜注人免疫球蛋白中IgG含量，結(jié)果表明IgG濃度在0.25～20 mg·mL－1范圍內(nèi)與峰面積呈良好的相關(guān)性(r=0.9999)。此方法檢測人IgG重現(xiàn)性好，選擇性高，樣品不需做預(yù)處理，操作簡便快速，一般在幾分鐘至幾十分鐘可完成檢測。但是由于親和層析柱價(jià)格昂貴，壽命較短，使得實(shí)驗(yàn)成本較高，不適用于大批量檢測，探尋廉價(jià)易得的固定相或者延長柱壽命可使該方法得到更好普及。

目前親和層析柱較為常用的載體有瓊脂糖凝膠(Sepharose)和聚丙烯酰胺凝膠(polyacrylamide gel)［7］，常用的配基有蛋白A(Protein A)和蛋白G(Protein G)。蛋白A是金黃色葡萄球菌的細(xì)胞壁蛋白，僅與人IgG分子的Fc區(qū)具有很強(qiáng)的特異性親和作用。周冬梅等［8］建立了以蛋白A作為配基的親和膜色譜柱檢測人血清中IgG的方法，該方法檢測時(shí)間僅需0.5到 5 min，并具有良好的重現(xiàn)性(變異系數(shù)為3.6%)。蛋白G是鏈球菌細(xì)胞的細(xì)胞壁蛋白，其對非人源的IgG同樣具有很強(qiáng)的親和作用，可用于多種動(dòng)物IgG的檢測，如兔、鼠、牛等。此外，親和層析的一種改良方法－灌注層析使用高度疏水的聚苯乙烯－二乙烯基苯作為柱填料，可允許有更高的流速，分析速度和靈敏度均有相應(yīng)提高［9］。

3 生物傳感器技術(shù)

3.1 表面等離子共振技術(shù) 表面等離子共振(surface plasmon resonance，SPR)生物傳感器是基于SPR技術(shù)分析生物分子相互作用的一種前沿分析技術(shù)，此方法可原位和動(dòng)態(tài)測量各種生物分子之間的相互作用過程，廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)、藥物分析及食品等多個(gè)領(lǐng)域［10］。羅陽等［11］人利用SPR免疫傳感器芯片同步定量檢測尿液中多種微量蛋白，分析快速，結(jié)果準(zhǔn)確，其中 IgG檢測靈敏度可達(dá)22 μg·L－1。SPR生物傳感器的優(yōu)點(diǎn)是反應(yīng)過程可實(shí)時(shí)監(jiān)控，樣品無需標(biāo)記，也可以無須純化各種生物組分。

3.2 電化學(xué)發(fā)光免疫分析 電化學(xué)發(fā)光免疫分析(electrochemiluminescence immunoassay，ECLIA)是在電極表面由電化學(xué)引發(fā)的特異性化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，其檢測原理為采用電化學(xué)發(fā)光劑三聯(lián)吡啶釕［Ru(bpy)3］2+標(biāo)記抗體，通過抗原－抗體反應(yīng)和磁珠分離技術(shù)，根據(jù)三聯(lián)吡啶釕在電極上發(fā)出的光強(qiáng)度對待測的抗體或抗原進(jìn)行定量分析［12］。ECLIA在具體的分析中可分直接法、競爭法和雙抗夾心法。云雯等［13］利用雙抗體夾心法檢測人血清中IgG，檢出限可達(dá)20 μg·L－1。該方法具有靈敏度高，檢測速度快，可在線分析等優(yōu)點(diǎn)。電極的構(gòu)建和生物分子在電極表面的固定對傳感器的性能影響較大，與脂質(zhì)體免疫分析技術(shù)相結(jié)合使該項(xiàng)技術(shù)有更高的靈敏度［14，15］，但由于試劑昂貴，不適于推廣普及。

4 共振瑞利散射法

瑞利散射是指半徑比光的波長小很多的微粒對入射光的散射，當(dāng)瑞利散射與散射分子吸收帶接近或者相同時(shí)，散射強(qiáng)度大大提高，共振瑞利散射(resonance Rayleigh scattering，RRS)檢測技術(shù)就是近年來基于這一原理建立的一種新的分析技術(shù)。RRS可采用有機(jī)染料作為光散射探針分析蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子。有機(jī)染料分子在生物大分子表面，可形成較大的聚集體，使體系的RRS信號(hào)增強(qiáng)，據(jù)此測定痕量的蛋白質(zhì)或核酸。黃克靖等［16］利用甲基藍(lán)作為熒光染色劑，建立了在低pH的BR(Britton－Robinson)緩沖溶液條件下測定人血清中IgG的方法，此方法靈敏度高，分析快速，而且具有較好的選擇性。

5 總結(jié)

綜上所述，應(yīng)用免疫學(xué)的原理建立的方法是檢測人IgG含量的主流，基于免疫學(xué)原理檢測人IgG的自動(dòng)生化分析儀以及酶聯(lián)免疫試劑盒分析簡便快速，通量高，是目前醫(yī)療機(jī)構(gòu)檢測人IgG的主要方法;而色譜分析法操作簡便，自動(dòng)化程度高，探尋廉價(jià)易得的耗材將使其有更廣闊的應(yīng)用和發(fā)展空間;此外，由于生物傳感器技術(shù)有靈敏度高，樣品無需處理或僅需簡單處理，可在線實(shí)時(shí)分析，環(huán)境污染小等諸多優(yōu)點(diǎn)，成為目前研究熱點(diǎn)，隨著這項(xiàng)技術(shù)的日趨成熟會(huì)被越來越多的應(yīng)用到臨床人體液IgG檢測中。

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