眼鏡蛇神經(jīng)毒素大鼠不同腦區(qū)給藥的鎮(zhèn)痛作用研究

劉啟萍，郝永龍

(山東中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250001)

眼鏡蛇神經(jīng)毒素肌肉注射給藥能明顯提高實(shí)驗(yàn)大、小鼠的痛閾，具有鎮(zhèn)痛作用［1］。連續(xù)小劑量肌肉注射可使大鼠某些腦區(qū)的腦啡肽樣物質(zhì)含量明顯升高，眼鏡蛇神經(jīng)毒素的鎮(zhèn)痛作用不一定是直接作用于嗎啡受體而產(chǎn)生。至于眼鏡蛇神經(jīng)毒素鎮(zhèn)痛機(jī)理的研究，只局限在中腦導(dǎo)水管部位注射微量眼鏡蛇神經(jīng)毒素的研究，本文通過第三腦室、下丘腦和尾狀核都是與鎮(zhèn)痛有關(guān)的中樞部位，更進(jìn)一步為研究眼鏡蛇神經(jīng)毒素的鎮(zhèn)痛機(jī)理提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 試藥 純化的眼鏡蛇神經(jīng)毒素(α－Cobrotoxin)由廣西醫(yī)科大學(xué)蛇毒研究所提供。電泳呈單一區(qū)帶，相對分子質(zhì)量約7000 u(SDS法)，等電聚焦電泳測定PI為9.5。套管、戊巴比妥鈉、乙醚均由浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥理教研室提供。

1.2 動(dòng)物 SD大鼠80只，雄、雌各半，體重(220±30)g，均由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 動(dòng)物篩選 照藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)［2］大鼠熱刺激甩尾法要求篩選大鼠。選用2～10 s內(nèi)引起甩尾反應(yīng)的大鼠，將反應(yīng)過激和反應(yīng)遲鈍的大鼠剔除。

2.2 大鼠不同腦區(qū)內(nèi)埋植套管 取經(jīng)篩選的SD大鼠30只，隨機(jī)分為5組，每組6只，即對照組、第三腦室組、中腦導(dǎo)水管組、下丘腦組、尾狀核組。分別用質(zhì)量濃度為3%戊巴比妥鈉30 mg·kg－1腹腔注射麻醉，固定于大鼠立體定位儀(江灣Ⅰ型C)上，用碘酒、75%消毒醫(yī)用酒精消毒皮膚，頭頂正中切開暴露顱骨，按大鼠腦立體定位圖譜［3］中腦導(dǎo)水管坐標(biāo)A(前囟后1 mm)，L(正中線旁開 1 mm)，H(深度 5.5 mm);第三腦室坐標(biāo)A(前囟后1.3 mm)，L(正中線旁開0 mm)，H(深度5 mm);下丘腦坐標(biāo)A(前囟后1.8 mm)，L(正中線旁開 0.8 mm)，H(深度 6.4 mm);尾狀核坐標(biāo) A(前囟前 1.2 mm)，L(正中線旁開2 mm)，H(深度5 mm)下一側(cè)各腦區(qū)內(nèi)埋管，將外徑1.2 mm，長度7 mm的不銹鋼套管埋植在靶位之上1 mm處，用慶大霉素注射液噴灑創(chuàng)面后，用牙托粉固定于顱骨表面。

2.3 各腦區(qū)內(nèi)給藥 埋植套管7 d后，分別將各組大鼠用乙醚輕度麻醉置于大鼠腦立體定位儀上，用1 μL和50 μL微量注射器針頭插入套管，定位于各腦區(qū)。第三腦室為10 μL，其他不同腦區(qū)的每組大鼠分別注射1 mg·mL－1的α－Cobrotoxin生理鹽水溶液各0.5 μL，于2 min內(nèi)勻速注射完畢，避免藥液外溢。對照組給藥方式同其它組，注射等量生理鹽水。

2.4 測定痛閾 參照藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)，在大鼠活動(dòng)正常的情況下置大鼠于固定筒內(nèi)，尾部暴露于外，將大鼠尾下部垂直浸入預(yù)熱(55±0.5)℃的恒溫水浴鍋中，浸入長度4 cm左右，以大鼠甩尾的潛伏期作為痛反應(yīng)指標(biāo)。給藥前間隔5 min測3次，取其平均值為基礎(chǔ)痛閾。給藥后每隔10 min測定一次，1 h后每30 min測定一次，共測3 h。所測值與基礎(chǔ)痛閾相比較。結(jié)果顯示:大鼠不同腦區(qū)定位注射神經(jīng)毒素后10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min、90 min、120 min、150 min、180 min用熱水浴甩尾法測定其痛閾，可以看出，下丘腦效果最好，10 min痛閾與生理鹽水組相比，即有顯著差異，30 min達(dá)高峰，并可持續(xù)180 min，痛閾最大提高213%;中腦導(dǎo)水管給藥后20 min達(dá)峰，痛閾最大提高167%(P＜0.01);第三腦室給藥后20 min達(dá)峰，痛閾最大提高142%(P＜0.01);尾狀核給藥后50 min達(dá)峰，痛閾最大提高135%(P＜0.01)。結(jié)果見圖1和表1。

表1 眼鏡蛇神經(jīng)毒素大鼠不同腦區(qū)注射前、后的痛閾變化(n=6SD)

表1 眼鏡蛇神經(jīng)毒素大鼠不同腦區(qū)注射前、后的痛閾變化(n=6SD)

注:與 NS組痛閾值比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

給藥后(t/s)in 150 min 180 min對照組(NS) 5.44±1.46 5.33±2.16 5.67±1.03 5.17±1.47 5.5±1.05 5.0±1.41 5.33±2.16 5.16±1.6組別給藥前(t/s)10 min 20 min 30 min 40 min 50 min 60 min 90 min 120 m 5.5±1.52 5.5±1.52 5.67±1.14中腦導(dǎo)水管組(2.5 μg·kg－1)4.94±0.67 9.67±0.94＊＊ 13.17±3.23＊＊ 12.17±2.73＊＊ 11.67±2.36＊＊ 10.83±1.86＊＊ 10.33±1.97＊＊ 10.0±1.15＊＊ 9.33±1.37＊＊ 8.33±2.13＊＊ 6.67±1.60*下丘腦組(2.5 μg·kg－1) 5.16±0.27 9.5±2.07＊＊ 14.17±3.31＊＊ 16.17±4.36＊＊ 13.67±2.88＊＊ 14.0±4.15＊＊ 13.17±4.36＊＊ 12.17±3.19＊＊ 10.5±3.02＊＊ 8.67±2.94＊＊ 7.83±1.72*第三腦室組(2.5 μg·kg－1)5.38±0.43 6.83±1.46* 13.0±2.30＊＊ 11.5±2.22＊＊ 10.5±2.14＊＊ 10.3±2.36＊＊ 9.5±2.75＊＊ 9.33±1.49＊＊ 9.17±2.11＊＊ 7.83±1.86* 6.83±1.07*尾狀核組(2.5 μg·kg－1) 5.23±0.83 6.33±0.94 7.16±1.07* 9.33±1.11＊＊ 11.33±1.79＊＊ 12.33±1.69＊＊ 11.16±1.57＊＊ 10.33±1.11＊＊ 9.5±0.96* 8.17±1.34* 7.5±0.95*

圖1 眼鏡蛇神經(jīng)毒素不同腦區(qū)中樞性鎮(zhèn)痛作用

2.5 注射部位鑒定 每次實(shí)驗(yàn)結(jié)束后將大鼠處死，解剖大腦確定插入的部位是否準(zhǔn)確。然后取腦組織置于10%甲醛溶液中固定，做0.2～0.5 mm連續(xù)腦組織切片，根據(jù)注射針頭留下的痕跡準(zhǔn)確確定其是否埋管準(zhǔn)確。

3 討論

痛覺的傳遞系統(tǒng)包括三個(gè)主要部分，即外周感覺神經(jīng)、脊髓到腦干和丘腦的神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)以及丘腦和大腦皮質(zhì)的相互聯(lián)系，包括丘腦、腦橋、中腦在內(nèi)的皮質(zhì)下中樞和大腦皮質(zhì)構(gòu)成了痛覺中樞。其中，丘腦的許多核團(tuán)對疼痛有著顯著的調(diào)控作用，傳遞痛覺的脊髓丘腦束纖維就終止在丘腦的不同核團(tuán)上。在這些核團(tuán)中，含有對傷害性刺激的痛敏神經(jīng)元，參與疼痛的興奮或抑制作用。同時(shí)，刺激下丘腦的前部、中部、后部和視上核可提高痛閾，產(chǎn)生明顯的鎮(zhèn)痛作用。因此，丘腦是疼痛傳遞和調(diào)制中非常重要的整合中樞［4，5］。

本實(shí)驗(yàn)通過對大鼠下丘腦、中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)、第三腦室和尾狀核四部位定位注射蛇神經(jīng)毒素，結(jié)果表明這四個(gè)部位都具有較明顯的鎮(zhèn)痛作用，而下丘腦為鎮(zhèn)痛最佳部位。眼鏡蛇神經(jīng)毒素的中樞作用部位為下丘腦、尾狀核、第三腦室、PAG、海馬和皮質(zhì)等腦區(qū)。因本實(shí)驗(yàn)中動(dòng)物樣本數(shù)和腦區(qū)個(gè)數(shù)有限，關(guān)于注射眼鏡蛇神經(jīng)毒素后，中樞較高含量的乙酰膽堿和內(nèi)源性阿片肽的產(chǎn)生機(jī)制，及其M型膽堿受體作用仍有待深入研究。

［1］陳汝筑，吳秀榮.眼鏡蛇神經(jīng)毒素的鎮(zhèn)痛作用［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，1988，4(2):113 －117.

［2］徐叔云，卞如濂，陳修.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)［M］.第2版.北京:人民衛(wèi)生出版社，1991:90.

［3］Paxinos G，Waston C.The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates［M］.Second Edition.Sydney:Academic Press，1986:30.

［4］Helmchen C，Lindig M，Petersen D，et al.Disappearance of central thalamic pain syndrome after contralateral parietal lobe lesion:implications for therapeutic brain stimulation［J］.Pain，2002，98(3):325 －330.

［5］Desbois C，Villanueva L.The organization of lateral ventromedial thalamic connections in the rat:a link for the distribution of nociceptive signals to widespread cortical regions［J］.Neuroscience，2001，102(4):885 －898.