吡格列酮對糖尿病大鼠氧化應(yīng)激和腎組織基質(zhì)積聚的影響

張 紅，胡長軍，陸衛(wèi)平

（南京醫(yī)科大學(xué)附屬淮安第一醫(yī)院內(nèi)分泌科，江蘇 淮安 223300）

糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病的慢性微血管并發(fā)癥之一，也是慢性腎功能衰竭和需要腎臟替代治療的終末期腎衰（end－stage renal disease，ESRD）的主要原因。細(xì)胞外基質(zhì)蛋白（extracellular matrix，ECM）在腎小球及間質(zhì)的積聚是DN發(fā)生的中心環(huán)節(jié)，從而導(dǎo)致腎小球纖維化硬化的發(fā)生［1］。Brownlee［2］認(rèn)為氧化應(yīng)激是引起糖尿病慢性并發(fā)癥的主要發(fā)病機(jī)制之一，在DN的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。研究表明，噻唑烷二酮類（thiazolidinediones，TZDs）藥物對DN具有直接有益的保護(hù)作用，本實(shí)驗(yàn)以此為依據(jù)從生化指標(biāo)、氧化應(yīng)激、形態(tài)學(xué)改變、基質(zhì)積聚表達(dá)等方面，研究吡格列酮（pioglitazone，PIO）對鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）誘導(dǎo)的糖尿病大鼠腎臟保護(hù)作用及相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 STZ購自Sigma公司，丙二醛（malondialdehyde，MAD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、銅鋅超氧化物歧化酶（Cu，Zn superoxide dismutase；Cu，Zn－SOD）由南京建成生物工程研究所提供，大鼠Ⅳ型膠原（typeⅣCollagen，Col－Ⅳ）抗體購自美國Santa Cruz公司，免疫組化二步法試劑盒購自北京中山公司，吡格列酮由江蘇恒瑞醫(yī)藥公司提供。

1.2 方法

1.2.1 模型建立和分組 STZ 60mg／kg一次性腹腔注射，48 h測尾靜脈血糖，持續(xù)大于16.7mmol／L者確定為糖尿病大鼠；將SD大鼠分3組:正常對照組（NC組，15只）；糖尿病對照組（DM 組，15只）；糖尿病PIO治療組（DP組，15只）:20mg·kg－1·d－1PIO無菌水混懸液灌胃［3］，其余予無菌水灌胃。

1.2.2 標(biāo)本收集檢測 8周末代謝籠收集24h尿，檢測尿清蛋白（microalbuminuria，MAU），麻醉腹主動(dòng)脈采血，檢測糖化血紅蛋白（HbA1c）、尿素氮（BUN）。腎指數(shù)（KI）以腎質(zhì)量／體質(zhì)量（g／kg）表示。腎臟稱質(zhì)量后用于 MAD、CAT、Cu及Zn－SOD檢測及電鏡觀察、蠟塊制備。化學(xué)比色法測定MDA、CAT及Cu，Zn－SOD含量及活性，步驟按說明書操作。

1.2.3 免疫組化 Col－Ⅳ采用二步法，步驟按說明書進(jìn)行，顯色強(qiáng)度用LEICA Qwin圖像系統(tǒng)分析，以光密度（OD）值表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行資料分析，計(jì)量數(shù)據(jù)用表示，組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 生化指標(biāo)及氧化應(yīng)激水平結(jié)果 DM及DP組HbA1c較NC組升高，DP組與DM組HbA1c比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。DM 組及DP組的KI、BUN、MAU均高于 NC組，DP組顯著低于DM組（P＜0.01），見表1。

2.2 腎組織氧化應(yīng)激水平變化 PIO治療后的大鼠，腎組織CAT和Cu，Zn－SOD水平升高，而 MAD水平被抑制（P＜0.01），見表2。

2.3 腎組織病理學(xué)變化 光鏡下DM組大鼠腎小球細(xì)胞數(shù)顯著增多，腎小球毛細(xì)血管狹窄甚至閉塞，電鏡下見腎小球基底膜增厚，系膜細(xì)胞增生，足突微絨毛化，PIO治療后病理學(xué)損害明顯改善，見圖1、2。

2.4 免疫組化 DM組大鼠腎Col－Ⅳ在腎小球腎小管表達(dá)增多，DP組大鼠Col－Ⅳ明顯減低（P＜0.01），見圖3。染色強(qiáng)度OD值，見表3。

表1 各組大鼠HbA1c、BUN、KI、MAU比較（）

表1 各組大鼠HbA1c、BUN、KI、MAU比較（）

＊:P＜0.01，與NC組比較；▲:P＜0.01，與DM組比較。

組別 HbA1c（%）BUN（mmol／L） KI（g／kg） MAU（μg／mg）NC組3.54±0.455.76±1.033.52±0.398.05±2.05 DM組 7.60±1.19＊18.80±2.87＊ 8.82±1.30＊118.24±9.48＊DP組 7.41±0.9411.05±2.24▲ 5.56±0.83▲ 68.23±9.64▲

表2 各組大鼠 M AD、CAT、Cu－ZnSOD比較（）

表2 各組大鼠 M AD、CAT、Cu－ZnSOD比較（）

＊:P＜0.01，與NC組比較；▲:P＜0.01，與DM組比較。

組別 MAD（mmol／mg） CAT（U／mg） Cu，Zn－SOD（U／mg）NC組6.21±1.56 730.0±69.5 50.5±4.9 DM組 11.35±2.77＊ 516.3±59.8＊ 39.6±5.2＊DP組 7.81±1.94▲ 688.5±78.2▲ 46.7±6.1▲

表3 各組大鼠腎組織Ⅳ型膠原蛋白表達(dá)比較（）

表3 各組大鼠腎組織Ⅳ型膠原蛋白表達(dá)比較（）

＊:P＜0.01，與NC組比較；▲:P＜0.01，與DM組比較。

組別C－ⅣNC組33.22±5.15 DM 組 70.34±9.51＊DP組 36.97±7.32▲

圖1 各組大鼠腎組織病理形態(tài)學(xué)變化（HE染色，×400）

圖2 各組大鼠腎小球超微結(jié)構(gòu)（×6000）

圖3 大鼠腎組織Col－Ⅳ免疫組化表達(dá)變化（二步法，×400）

3 討 論

隨著人們生活水平的提高及人口老齡化生活方式轉(zhuǎn)變等，糖尿病的患病率迅速增加，其中1／3的患者最終進(jìn)展為DN，由此也導(dǎo)致了ESRD的大量增長［4－5］。但是DN發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚，其中高血糖對DN的影響一直以來是人們關(guān)注的重要領(lǐng)域，長期高血糖引起的多元醇代謝通路的激活、蛋白質(zhì)的非酶糖化、蛋白激酶C過度活化、己糖途徑激活、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活化等從不同作用環(huán)節(jié)促進(jìn)了DN的病理進(jìn)程［6－7］。反應(yīng)性氧簇（reactive oxygen species，ROS）是上述途徑發(fā)揮作用的主要分子鏈，它通過促進(jìn)ECM過表達(dá)，加速腎臟纖維化，最終導(dǎo)致 ESRD 的發(fā)生［8－9］。

ROS是超氧陰離子（O2－）、過氧化氫（H2O2）和羥自由基（OH－）等活性含氧化合物的總稱，氧化應(yīng)激（oxidative stress，OS）時(shí)ROS產(chǎn)生增多和／或清除減少，導(dǎo)致其在體內(nèi)蓄積而引起的分子、細(xì)胞和機(jī)體的損傷［10］。MAD是反應(yīng)機(jī)體氧化能力的重要指標(biāo)，在DN中的作用主要是與糖基化膠原蛋白發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)而影響膠原蛋白的降解，使ECM積聚增加，加速DN進(jìn)展［11］。Col－Ⅳ是腎小球基底膜和ECM的主要成分，故本實(shí)驗(yàn)選擇Col－Ⅳ作為DN基質(zhì)積聚的一項(xiàng)研究指標(biāo)［12］。SOD是體內(nèi)最重要的抗氧化酶之一，是清除ROS的第一道防線，Cu，Zn－SOD存在于細(xì)胞質(zhì)中，其主要作用是清除 O2－，防止生物膜脂質(zhì)過氧化損傷，故SOD水平的高低可間接反映機(jī)體的抗氧化能力。CAT活性的降低可間接反映H2O2生成的減少，是反映機(jī)體抗氧化能力的重要指標(biāo)之一［13］。

臨床上PIO主要用于治療2型糖尿病，它通過結(jié)合并激活過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator activated receptor，PPAR－γ）進(jìn)而調(diào)節(jié)與胰島素效應(yīng)有關(guān)的多種基因的轉(zhuǎn)錄，以此達(dá)到降低血糖的目的。PPAR－γ除在胰島素主要作用靶組織表達(dá)外，還表達(dá)于單核／吞噬細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、腎小球系膜細(xì)胞及上皮細(xì)胞等，它可以抑制成纖維細(xì)胞增殖和巨噬細(xì)胞浸潤、抑制炎癥介質(zhì)，調(diào)節(jié)系膜細(xì)胞增殖和分化、抑制血管活性物質(zhì)合成，提示PIO直接的腎臟保護(hù)作用可能與上述機(jī)制有關(guān)［14］。

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，8周時(shí)DM組大鼠的MAU、KI、BUN增加（P＜0.01），即出現(xiàn)腎臟肥大，尿蛋白排泄增加，病理形態(tài)上顯示毛細(xì)血管狹窄或閉塞，系膜細(xì)胞增生，腎小球基底膜增厚，足突微絨毛化，說明模型已出現(xiàn)DN典型的功能改變及病理學(xué)異常。DM組大鼠腎組織中MDA含量明顯高于NC組，而Cu，Zn－SOD和CAT活性明顯下降（P＜0.01），說明糖尿病大鼠腎組織氧化效應(yīng)增強(qiáng)，抗氧化能力下降，即氧化應(yīng)激反應(yīng)出現(xiàn)。PIO治療8周后的DP組大鼠，腎臟肥大減輕，尿蛋白排泄減少，病理學(xué)損害改善，同時(shí)MAD水平下降，Cu，Zn－SOD和CAT活性增強(qiáng)（P＜0.01）。免疫組化結(jié)果顯示，DM組大鼠Col－Ⅳ蛋白在腎小球表達(dá)增多，PIO治療后，Col－Ⅳ表達(dá)減少（P＜0.01），而 HbA1c并未降低（P＞0.05），說明PIO治療可通過下調(diào) MDA水平、提高Cu，Zn－SOD和CAT的活性，有效地抑制基質(zhì)積聚，進(jìn)而延緩DN病理學(xué)進(jìn)程，而且這種作用并未依賴血糖水平的降低。

綜上所述，PIO具有DN的保護(hù)作用，它可以通過抑制氧化應(yīng)激介導(dǎo)的基質(zhì)積聚而實(shí)現(xiàn)，且這種作用并不依賴血糖水平的降低，具有直接的腎臟保護(hù)作用。研究表明，TZDs同時(shí)具有控制血糖、調(diào)節(jié)血壓、改善血脂、抑制細(xì)胞周期進(jìn)展、調(diào)節(jié)細(xì)胞因子及炎性因子表達(dá)等作用［15］。關(guān)于PIO的DN保護(hù)作用需要更多的研究證實(shí)。

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