電針結(jié)合重復(fù)經(jīng)顱磁刺激對(duì)焦慮模型大鼠中樞腎上腺皮質(zhì)激素受體基因表達(dá)的影響＊

周奇志，魏焦祿，蔡定均△，彭曉華，余曙光，鄭 重，方楊琪

（1.成都中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院針灸學(xué)實(shí)驗(yàn)室 610075；2.四川大學(xué)華西醫(yī)院心理衛(wèi)生中心電生理室，成都 610041；3.成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院針灸學(xué)校 610041）

研究顯示，焦慮障礙總體年發(fā)病率和終身患病率分別是10.6%和16.6%［1］；且治療成本高，干預(yù)措施的有效性與高成本并非成正比［2］。中樞特別是海馬、前額皮質(zhì)等邊緣結(jié)構(gòu)分布有大量的腎上腺皮質(zhì)激素受體［鹽皮質(zhì)激素受體（MR）和糖皮質(zhì)激素受體GR）］，MR和GR均可與糖皮質(zhì)激素結(jié)合，共同調(diào)節(jié)應(yīng)激、焦慮情緒等，且MR／GR系統(tǒng)的失平衡可導(dǎo)致焦慮情緒的發(fā)生。電針、重復(fù)經(jīng)顱磁刺激（repetitive transcranial magnetic stimulation，rTMS）治療焦慮障礙均顯示一定療效［3－4］，但總體療效還不夠突出，尚缺乏二者結(jié)合的效應(yīng)和機(jī)制研究。本課題擬探索電針結(jié)合rTMS抗焦慮協(xié)同效應(yīng)的部分中樞作用機(jī)制，為臨床尋求經(jīng)濟(jì)、有效和安全的治療措施，提供科學(xué)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 RAPID2型rTMS器，英國(guó) Magstim公司生產(chǎn)；PM－200十字迷宮視頻跟蹤系統(tǒng)，成都泰盟公司生產(chǎn)；基因擴(kuò)增儀（C1000，BIO－RAD）；熒光定量 PCR（CFX96，BIO－RAD）?？俁NA提取試劑盒（離心柱型）、Quantscript RT Kit Quant cDNA第一鏈合成試劑盒和Quant一步法逆轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈反應(yīng)（RT－PCR）試劑盒購(gòu)自北京TIANGEN生物技術(shù)公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組與模型復(fù)制 （1）實(shí)驗(yàn)條件:選用清潔級(jí)雄性SD大鼠50只，體質(zhì)量180～220g，購(gòu)自成都中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心［合格證書(shū)號(hào):川實(shí)動(dòng)管質(zhì)第SCXK（川）2009－11］；（2）分組:將50只大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、模針組、模磁組、磁針組，每組10只；（3）動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性馴養(yǎng)1周。參考單個(gè)持續(xù)刺激（single prolonged stress，SPS）方法［5］，復(fù)制焦慮模型，即禁錮2h，強(qiáng)迫性游水20min，乙謎麻醉至意識(shí)喪失后，立即放回原籠，單籠飼養(yǎng)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)方法 空白組:每天在相同的時(shí)間進(jìn)行與模針組相同的方法固定。模型組:在造模后次日，處理方法同空白組。模針組:在造模后次日進(jìn)行電針治療。穴位選擇:“百會(huì)”、“長(zhǎng)強(qiáng)”，依據(jù)《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》的動(dòng)物穴位圖譜模擬定位［6］。接電針治療儀，選用疏密波，頻率15～25次／分。每天1次，持續(xù)15 min，連續(xù)治療3d。模磁組:在造模后次日，對(duì)大鼠頭部進(jìn)行rTMS治療。運(yùn)動(dòng)閾值（motor threshold，MT）為75% ，刺激頻率18.3Hz，400個(gè)脈沖。每天1次，連續(xù)治療3d。磁針組:在造模后次日，對(duì)大鼠先后進(jìn)行電針和rTMS治療，方法同模針組和模磁組。

1.2.3 指標(biāo)檢測(cè)方法 （1）行為學(xué)檢測(cè):在治療結(jié)束后次日，按文獻(xiàn)［7－8］分別進(jìn)行曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)（open field，OF）和高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)（elevated plus maze，EPM）。（2）腦組織和血清采集:實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，采用乙醚輕度麻醉各組動(dòng)物，斷頭迅速取腦，置于液氮冷凍待測(cè)。參照腦立體定位圖譜［9］，取海馬和前額皮質(zhì)組織塊約20mg，進(jìn)行組織勻漿。（3）MR和GR基因表達(dá)指標(biāo)測(cè)試:按照相關(guān)試劑盒說(shuō)明書(shū)，運(yùn)用一步法RT－PCR測(cè)試基因表達(dá)。MR mRNA上游引物3′－AAC AAA ATG CCC CAC GGT TA－5′（20bp），下游引物3′－GGG ACG ATG CAA TGG ACT GT－5′（20bp）。GR mRNA上游引物3′－GGA TTT CCA GAG CCC ACC AT－5′（20bp），其下游引物3′－CAT TCC TGA TGG TCA CCT CG－5′（20bp）。

2 結(jié) 果

2.1 行為學(xué)實(shí)驗(yàn) 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果:與空白組相比，模型組大鼠垂直運(yùn)動(dòng)次數(shù)明顯減少（P＜0.05）；與模型組相比，模磁組、磁針組水平移動(dòng)格數(shù)、垂直運(yùn)動(dòng)次數(shù)顯著增加（P＜0.01），模針組垂直運(yùn)動(dòng)次數(shù)顯著增加（P＜0.01）；而磁針組較模針組、模磁組水平移動(dòng)格數(shù)、垂直運(yùn)動(dòng)次數(shù)均顯著增加（P＜0.05）。十字迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果:與空白組比較，模型組大鼠OT%值、OE%值明顯下降（P＜0.01）；與模型組相比，治療3組OT%值、OE%值均顯著增加（P＜0.05）。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)各組指標(biāo)比較（，n＝10）

表1 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)各組指標(biāo)比較（，n＝10）

▲:P＜0.05，與空白組比較；★:P＜0.05，與模型組比較；■:P＜0.05，與磁針組比較。

組別曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)水平移動(dòng)格數(shù) 垂直運(yùn)動(dòng)次數(shù)十字迷宮實(shí)驗(yàn)OT% OE%空白組 110.67±13.3518.45±4.32 0.36±0.12 0.46±0.19模型組 99.33±21.6212.67±3.78▲ 0.11±0.06▲ 0.13±0.12▲模針組 107.56±15.48■ 19.56±3.97★■ 0.31±0.14★ 0.32±0.11★模磁組121.00±13.65★■ 23.29±3.35★■ 0.30±0.12★ 0.29±0.06★磁針組 138.25±12.16★ 30.00±6.76★ 0.29±0.14★ 0.31±0.14★

析因設(shè)計(jì)的方差分析結(jié)果顯示，對(duì)行為學(xué)效應(yīng)指標(biāo)（OT%、OE%、水平移動(dòng)格數(shù)和垂直運(yùn)動(dòng)次數(shù)）電針治療的統(tǒng)計(jì)量F值分別為6.500、8.594、5.154和15.073，P 值分別為0.015、0.006、0.031和0.001，rTMS 4個(gè)指標(biāo)統(tǒng)計(jì)量F 值分別為4.617、5.043、21.778和36.140，P 值分別為0.038、0.031、0.000和0.000，可認(rèn)為兩種治療單獨(dú)用有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與表1結(jié)果基本一致。電針與rTMS同用時(shí)交互作用只在OT%、OE%兩指標(biāo)上差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F值分別為7.657和5.478，P值分別為0.009和0.025），表明在十字迷宮實(shí)驗(yàn)中電針、rTMS同時(shí)運(yùn)用顯現(xiàn)抗焦慮協(xié)同效應(yīng)。

2.2 各組大鼠海馬、前額皮質(zhì)MR和GR基因表達(dá)變化 大鼠經(jīng)SPS造模后，（1）模型組海馬GR mRNA的CT值、MR mRNA／GR mRNA的CT值比值均較空白組升高（P＜0.05）；而模針組和磁針組GR mRNA的CT值較模型組均有下降（P＜0.05）；MR mRNA各組差異不明顯（P＞0.05）。結(jié)果見(jiàn)表2。（2）模型組前額皮質(zhì) MR mRNA和GR mRNA的CT值以及比值與空白組、治療組比較差異不明顯（P＞0.05）。

由于CT值與起始模板拷貝數(shù)成反比，CT值越大，起始模板拷貝數(shù)越少，表示基因表達(dá)量越少。因此結(jié)果提示，造模后模型動(dòng)物海馬GR基因表達(dá)量、MR mRNA／GR mRNA明顯低于正常動(dòng)物，治療各組均顯示一定程度改善，且電針和電針結(jié)合rTMS對(duì)海馬GR基因表達(dá)量影響顯著。

表2 各組大鼠海馬MR和GR的mRNA CT值及其比值的比較（，n＝10）

表2 各組大鼠海馬MR和GR的mRNA CT值及其比值的比較（，n＝10）

▲:P＜0.05，與空白組比較；★:P＜0.05，與模型組比較。

組別 MRmRNA GR mRNA MR mRNA／GR mRNA空白組18.72±1.5916.93±2.26 1.12±0.18模型組 17.92±1.38 18.94±2.42▲ 0.96±0.11▲模針組 17.82±2.3916.89±2.18★ 1.07±0.20模磁組 17.18±2.4617.08±2.32 1.03±0.26磁針組 17.43±2.1916.76±1.45★1.04±0.13

3 討 論

焦慮障礙（anxiety disorder）是包括廣泛性焦慮障礙、恐懼癥、驚恐發(fā)作、創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙以及強(qiáng)迫癥等在內(nèi)的一組臨床障礙［10］。經(jīng)過(guò)半個(gè)多世紀(jì)各國(guó)學(xué)者的大量研究，已相繼成功建立了各種各樣的焦慮動(dòng)物模型和檢測(cè)方法。目前較多以SPS方法復(fù)制創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙（post traumatic stress disorder，PTSD）大鼠焦慮模型［5，7，11－12］。OF和 EPM 兩項(xiàng)實(shí)驗(yàn)已成為國(guó)際公認(rèn)有效評(píng)價(jià)動(dòng)物焦慮情緒行為的常用測(cè)試方法［7－8］。本研究選用SPS方法，且單籠飼養(yǎng)，造成動(dòng)物軀體和心理應(yīng)激刺激，模型動(dòng)物與正常比較有明顯的焦慮樣反應(yīng)，說(shuō)明該焦慮模型塑造成功。本研究結(jié)果顯示，電針、rTMS均有改善焦慮情緒反應(yīng)的作用，這與文獻(xiàn)報(bào)道有一致性［3－4，13］。電針結(jié)合rTMS抗焦慮協(xié)同效應(yīng)的研究雖未見(jiàn)報(bào)道，但本研究結(jié)果顯示電針結(jié)合rTMS治療焦慮抑郁具有協(xié)同效應(yīng)［14］。

目前關(guān)于電針結(jié)合rTMS抗焦慮機(jī)制研究尚缺乏。近年來(lái)研究表明MR／GR系統(tǒng)對(duì)焦慮、恐懼情緒反應(yīng)等起重要作用。研究顯示，運(yùn)用SPS造模大鼠，24h急性應(yīng)激后海馬GR和MR的mRNA均降低，可致 MR／GR比值下降，7、14d后GR升高、MR仍下降，MR／GR比值降低［12］。在社會(huì)孤立應(yīng)激模型（單籠飼養(yǎng)）研究中，應(yīng)激1周后在海馬和丘腦GR結(jié)合率降低、頂葉皮質(zhì)和垂體未見(jiàn)變化，MR水平也未見(jiàn)變化；3周后在海馬和丘腦下降的GR回復(fù)至正常水平，而頂葉皮質(zhì)GR結(jié)合率卻下降，海馬和中隔組織的MR水平嚴(yán)重低下，提示社會(huì)應(yīng)激刺激導(dǎo)致皮質(zhì)激素受體持續(xù)下調(diào)以及不同腦區(qū)不同階段GR和MR有不同變化［15］。本項(xiàng)研究結(jié)果顯示，造模后5d動(dòng)物海馬GR基因表達(dá)量、MR mRNA／GR mRNA比值均發(fā)生了明顯改變，即顯著低于正常水平，而海馬 MR及前額皮質(zhì)GR和MR mRNA表達(dá)水平均未現(xiàn)變化，這與文獻(xiàn)報(bào)道有一定相似性。本研究3種治療對(duì)模型動(dòng)物海馬GR mRNA表達(dá)量均有一定程度改善，且電針和電針結(jié)合rTMS影響明顯。結(jié)合本研究結(jié)果，電針結(jié)合rTMS具有抗焦慮協(xié)同效應(yīng)，其機(jī)制可能主要與改變海馬GR基因表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，本研究初步揭示電針結(jié)合rTMS具有抗焦慮協(xié)同效應(yīng)，其作用可能與調(diào)節(jié)腎上腺皮質(zhì)激素受體基因表達(dá)相關(guān)，而基因表達(dá)改變后其下游分子事件是否參與了電針結(jié)合rTMS協(xié)同抗焦慮作用，尚待進(jìn)一步探究。

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