角蛋白降解菌分離、鑒定及其降解機制研究

齊志國 張鐵鷹 董杰麗 杜家菊

(1.中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所，動物營養學國家重點實驗室，北京100193；2.山東理工大學生命科學學院，山東淄博 255049)

羽毛和羊毛是自然界中最主要的角蛋白資源，然而其內部含硫氨基酸豐富，二硫鍵多，致使結構極穩定。傳統物理化學處理角蛋白的方法存在諸多不足，而利用微生物和酶等生物學方法處理角蛋白，條件溫和、污染小、氨基酸破壞低，對合理利用角蛋白資源和緩解蛋白資源短缺具有現實意義。細菌、真菌、放線菌等多種微生物可降解角蛋白，其破壞角蛋白二硫鍵的假說較多，主要包括硫解理論[1]、物理壓力理論[2]和酶解理論[3]等。近年來，二硫鍵還原酶在角蛋白降解中的作用日益受到關注。Yamamura等[4]于嗜麥芽寡養單胞菌發酵液中分離出了二硫鍵還原酶和蛋白水解酶，并證實二硫鍵還原酶對角蛋白的降解具有較強促進作用。Prakash 等[5]、Ramnani等[6]和 Ghosh 等[7]亦先后在水解角蛋白的微生物發酵液中檢測到了二硫鍵還原酶，進一步證實了二硫鍵還原酶在微生物降解角蛋白中的關鍵作用。本實驗通過篩選獲得高效羽毛角蛋白降解菌,對其胞內與胞外酶活組成、發酵液中含硫離子、巰基和可溶性蛋白含量測定分析,探討其降解羽毛角蛋白的機制，為提高其對角蛋白生物降解提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 羽毛粉的制備和培養基

分別將雞羽毛和羊毛用洗滌劑揉搓洗凈，121℃高壓滅菌1 h，再用清水洗凈，然后80℃烘48 h，冷卻后粉碎過100目篩，用于培養基制備和微生物發酵。

選擇培養基：羽毛粉 10 g、瓊脂 20 g、NaCl 0.5 g、K2HPO41 g、KH2PO40.4 g、蒸餾水 1 000 ml，pH 值 7.4～7.6，121℃滅菌 20 min。

種子培養基：牛肉膏5 g、蛋白胨 10 g、NaCl 0.5 g、K2HPO41 g、KH2PO40.4 g、蒸餾水 1 000 ml，pH 值7.4～7.6，121℃滅菌 20 min。

發酵培養基：羽毛粉 10 g、NaCl 0.5 g、K2HPO40.7 g、KH2PO40.35 g、蒸餾水 1 000 ml，pH 值 7.4～7.6，121 ℃滅菌20 min。

1.2 菌株的分離篩選、鑒定

1.2.1 菌株的分離篩選

采集腐爛羽毛及其周圍土壤，稱取適當樣品，將其梯度稀釋后涂布于以羽毛粉為唯一碳氮源基礎平板上，37℃倒置培養3 d左右，挑取有明顯水解圈的菌落進行傳代培養和馴化，并保存菌株。將菌株富集培養，取對數期種子液（0.6＜OD600＜0.8）接種于僅含有完整羽毛的無菌生理鹽水中搖瓶發酵，觀察羽毛降解情況，篩選降解羽毛速度最快菌株。

1.2.2 篩選菌形態觀察與分子鑒定

取分離的菌株于牛肉膏蛋白胨平板上劃線培養，37℃恒溫培養48 h，觀察菌落的形狀、顏色、光學特性、表面特性等。之后利用細菌基因組DNA快速提取試劑盒提取基因組，運用16S rDNA通用引物F27：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，R1429：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'擴增16S rDNA序列。PCR產物經測序后，結果在NCBI中運用Blast進行序列同源性搜索，應用Clustal X1.83進行多序列比對，采用MEGA4中Neighbor-joining方法建樹（Bootstrap重復數為 1 000）。

1.3 篩選菌對羽毛角蛋白的降解與機制研究

1.3.1 篩選菌發酵產物分析

取對數期（0.6＜OD600＜0.8）微生物種子液接種到50 ml/250 ml發酵培養基中，接種量4%，然后37℃、150 r/min 搖床分別培養 6、12、24、48、72、96 h，實驗處理均為3個重復。檢測上述不同發酵時間發酵液的胞外上清液中角蛋白酶活性、可溶性蛋白與巰基含量，對菌株CP-7發酵過程中的產物進行分析。

1.3.2 發酵上清液中含硫離子檢測

取發酵48 h菌株發酵液，離心制備上清液，檢測上清液中亞硫酸鹽和硫代硫酸鹽。硫代硫酸鹽采用兩種方法進行定性檢測。一是將上清液酸化至pH值3.0，若出現渾濁則為有硫代硫酸鹽產生；二是觀察上清液中加入FeCl3后是否會出現紫色。若有紫色出現表明有硫代硫酸鹽產生，反之則無。亞硫酸鹽則采用BaCl2檢測,若發酵過程產生亞硫酸鹽,當加入BaCl2溶液后，上清液則出現白色沉淀，且沉淀可以使KMnO4脫色，反之則無亞硫酸鹽產生。

1.3.3 胞內、胞外液酶活性分析

取發酵48 h菌株發酵液，制備胞外、胞內和混合粗酶液。分別以10mg羽毛、羊毛和酪蛋白為底物，檢測角蛋白和酪蛋白水解活性。同時檢測不同發酵時間胞內、胞外上清液中二硫鍵還原酶活性，探討不同酶液組分在角蛋白降解中的作用。

1.4 酶活性及相關生化指標分析方法

1.4.1 粗酶液制備

發酵液于 4 ℃、10 000×g離心 10 min，經 0.22 μm過濾器過濾后即為胞外粗酶液。收集胞體，懸浮于0.05 mol/l pH值10.0甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液中，用3倍磷酸鹽緩沖液洗脫3次，然后用1%的溶菌酶溶解1 h，再用超聲波破碎儀冰浴條件下破碎10 min，4℃下10 000×g離心10 min，上清液經過濾后為胞內粗酶液?；旌厦敢和ㄟ^1 ml的胞外粗酶液與1 ml胞內粗酶液混合得到。

1.4.2 角蛋白酶活性測定

采用Gradisar[8]所描述的方法為基礎，并加以修改。具體操作步驟:10mg羽毛粉與2.0 ml Tris/HCl（pH值 8.0，濃度0.05 mol/l）緩沖液混合，加入1.0 ml上清液，180 r/min、40℃保溫處理1 h，每隔10 min取出用力震蕩。反應結束時添加2.0 ml的6%三氯乙酸(TCA)終止反應，靜止 5 min，10 000×g 離心 15 min，上清液于280 nm下測定其吸光值，采用保溫前添加TCA的反應管作為對照。酶活定義:pH值8.0、40℃保溫處理1 h后，A280值升高0.01個單位為1 U。

1.4.3 酪蛋白水解活性測定

酪蛋白水解活性參照蛋白酶活性（紫外分光光度法）測定方法。

1.4.4 二硫鍵還原酶活性測定

二硫鍵還原酶活性結合Ellman[9]和Brown[10]的方法進行測定。1 ml由粗酶液、0.1 mol/l pH值8.0磷酸緩沖溶液和蒸餾水按3：2：5比例混合組成的酶混合液與1 ml含有5 mmol/l氧化型谷胱甘肽（GSSG）、5 mmol/l苯甲基磺酰氟(PMSF)的磷酸鹽緩沖溶液（pH值7.0）混合，在40℃恒溫水浴鍋中反應1 h。2 000×g離心10 min，取1.5 ml上清液與2.5 ml含有1 mM EDTA的pH值8.0磷酸緩沖液混合，加入100 μl Ellman試劑，靜置5 min待顏色穩定時于412 nm下測定吸光度并計算巰基含量。酶對照組為加入1 ml pH值7.0的磷酸緩沖溶液取代氧化型谷胱甘肽的處理組。酶活定義：1 kU二硫鍵還原酶活性相當于每毫升酶在40℃下每分鐘釋放出1 μmol巰基。

圖1 菌株CP-7完整羽毛降解

1.4.5 巰基與可溶性蛋白含量測定

巰基測定參考Ellman的方法并適當修改，可溶性蛋白含量運用Bradford法測定。

2 結果與分析

2.1 菌株的分離、鑒定

2.1.1 菌株的分離篩選

對采集的樣品富集稀釋并涂布羽毛選擇平板培養，共挑取27株平板產水解圈能力較強的菌株。將其于羽毛選擇平板上傳代馴化，并進行完整羽毛降解實驗。最終得到1株能夠完全降解羽毛的菌株CP-7，其在5 d內徹底降解完整羽毛(見圖1),故對其深入研究。

2.1.2 菌株鑒定

菌株CP-7生長于營養平板培養基，24 h后菌落直徑可達4 mm，菌落呈白色扁平狀，表面褶皺且多顆粒，粘稠，邊緣不整齊并伴有絲狀外延（見圖2）。

圖2 菌株CP-7菌群形態

經PCR手段擴增得到菌株CP-7的部分16S rDNA序列(見圖3),測序發現其長度為1 422 bp,序列提交至Genbank數據庫，接收號JN628975。將序列進行Blast比對，在GenBank數據庫中獲得相關菌株16S rDNA序列，應用Clustal X1.83進行多序列比對，采用MEGA4中Neighbor-joining方法建樹進行系統發育分析。如圖4所示，CP-7與地衣芽孢桿菌位于同一分支，同源性可達99%，初步判定該菌株為地衣芽孢桿菌，命名為Bacillus licheniformis CP-7。

圖3 菌株16S rDNA電泳圖譜

圖4 菌株CP-7系統發育樹

2.2 篩選菌對羽毛角蛋白的降解與機制分析

2.2.1 發酵液中可溶性蛋白含量與角蛋白酶活性

發酵液中可溶性蛋白含量和角蛋白酶活性檢測發現（見圖5、圖6），空白對照發酵液中可溶性蛋白產量低、變化小，而CP-7發酵液中可溶性蛋白含量在48 h最高，可達0.26mg/ml，之后隨發酵時間呈現逐漸下降趨勢。角蛋白酶活性隨發酵時間而逐漸增加，96 h酶活達到最高（8.43 U/ml），但72 h酶活性明顯近于穩定，可見角蛋白酶是該菌降解羽毛的基礎。

圖5 發酵液中可溶性蛋白變化

2.2.2 發酵液中巰基和含硫離子

CP-7發酵液中巰基濃度隨發酵時間逐漸升高（見圖7），96 h達到119 μM，這與角蛋白酶活力的變化趨勢一致，而空白對照發酵液中的巰基濃度幾乎無變化，這說明該菌株在降解羽毛角蛋白過程中有大量二硫鍵被還原。

圖6 發酵產酶情況

圖7 發酵液中巰基濃度變化

對菌株CP-7發酵液中亞硫酸鹽和硫代硫酸鹽等含硫離子檢測發現，上清液添加氯化鐵后并不顯紫色，酸化至pH值3.0后未出現渾濁，表明硫代硫酸鹽檢測呈陰性。當加入BaCl2溶液后，上清液出現白色沉淀，并且沉淀可以使KMnO4脫色，表明菌體在代謝過程中有亞硫酸鹽產生。這說明發酵液中的巰基可能被進一步轉化為了亞硫酸鹽。

2.2.3 胞內、胞外液中酶活組成

分別以羽毛、羊毛和酪蛋白為底物檢測胞內酶液、胞外酶液和胞內胞外混合酶液中蛋白酶活性。結果表明，以羽毛粉為底物時混合酶液角蛋白酶活性（7.13 U/ml）約為胞外酶液角蛋白酶活性（2.9 U/ml）2.5倍（P＜0.01），以羊毛為底物時兩者差異亦極顯著（P＜0.01），但酪蛋白水解活性差異不顯著（P＞0.05）（見圖8、圖9）。胞內酶液僅在以羊毛為底物時檢測到微弱角蛋白酶活性（0.25 U/ml），以羽毛和酪蛋白為底物時均未檢測到蛋白酶活性。

圖8 胞內、胞外、混合酶液角蛋白水解活性

圖9 胞內、胞外、混合酶液酪蛋白水解酶活性

該菌胞內、胞外酶液二硫鍵還原酶活性隨發酵時間的變化情況見圖10。胞外酶液各時間點均未檢測到二硫鍵還原酶活性，而胞內酶液均檢測到二硫鍵還原酶活性，表明胞內二硫鍵還原酶可能是胞外角蛋白酶活性提高的主要原因。其在發酵初始就達到較高水平，并在36 h達到最大，隨后迅速降低，這與胞外角蛋白酶產生規律不同。

圖10 胞內、胞外液二硫鍵還原酶活性

3 討論

角蛋白降解菌的篩選通常以產透明圈大小和酶活性高低為篩選標準，本實驗則以透明圈和完整羽毛降解法，獲得了1株可高效降解角蛋白菌株，經鑒定命名為Bacillus licheniformis CP-7。該菌可在5 d內將完整羽毛徹底降解，較之多數已知菌株降解角蛋白的能力強。地衣芽孢桿菌PWD-1為研究最為深入的降解菌，但其徹底降解羽毛需6 d[11]。吳小倫[12]和Suntornsuk[13]用透明圈法分別分離到短黃桿菌ZDM(Flavobacterium breve ZDM)和Bacillus sp.FK46，兩者搖瓶發酵5 d后羽毛被強烈降解，但均無法完全利用羽軸。由此可見，利用透明圈和完整羽毛降解相結合的方法篩選角蛋白降解菌更為有效。

當前關于角蛋白降解假說較多，但其核心均為二硫鍵的裂解。菌株CP-7發酵過程中還原得到大量巰基，同時伴有可溶性蛋白、角蛋白酶的產生。進一步研究發現，CP-7胞內液具有二硫鍵還原酶活性，并對胞外角蛋白酶活性具有顯著地促進作用，這表明其胞內的二硫鍵還原酶參與了角蛋白降解過程。Yamamura等[4]在嗜麥芽窄食單胞菌D-1中分離到了蛋白水解酶和二硫鍵還原酶。研究表明，兩種酶并不獨立起作用，而同時用于羽毛降解時，其蛋白酶水解活性比單獨使用提高約50多倍。另外，在蠟樣芽孢桿菌[5]、B.licheniformis RG1[6]和Bacillus halodurans PPKS-2[7]發酵液中也檢測到了二硫鍵還原酶活性，且對角蛋白酶具有激活作用。此外，二硫鍵還原酶可明顯提高枯草芽孢桿菌蛋白酶、胰蛋白酶以及蛋白酶K水解角蛋白的活性[4]。本研究還發現，二硫鍵還原酶活性在角蛋白降解初期較高，這或許與二硫鍵的早期斷裂相關。因此，二硫鍵還原酶在CP-7羽毛角蛋白降解中具有重要作用，促進了二硫鍵的裂解。

角蛋白二硫鍵的還原不僅與二硫鍵還原酶有關，其它化學因素也可能是破壞二硫鍵的重要原因。Onifade[14]發現幾種角蛋白降解真菌產生的亞硫酸鹽可以對角蛋白進行硫解。Kunert[1]也認為代謝產生的亞硫酸鹽和硫代硫酸鹽可能加速了二硫鍵裂解。王玲[15]發現在羽毛發酵過程中加入適當濃度的亞硫酸鹽和硫代硫酸鹽可以促進角蛋白降解。本研究在CP-7發酵液中也檢測到了亞硫酸鹽，但未檢測到硫代硫酸鹽。因此，CP-7裂解角蛋白二硫鍵與硫解作用可能具有密切關系。

4 結語

基于上述研究可知，運用透明圈和完整羽毛降解相結合的方法篩選角蛋白降解菌更為有效。篩選菌CP-7胞內二硫鍵還原酶顯著促進胞外角蛋白水解活性，這可能與二硫鍵還原酶裂解二硫鍵有關。此外，代謝產生的亞硫酸鹽與角蛋白降解亦可能密切相關。

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