紫穗槐菌根蛋白雙向電泳分離體系的構建1)

宋福強 王 健 孔祥仕 常 偉 王倡憲

(黑龍江大學，哈爾濱，150080)

紫穗槐(Amorpha fruticosa)又稱穗花槐，豆科紫穗槐屬，多年生落葉叢生小灌木，東北齊齊哈爾以南栽培［1］。紫穗槐被譽為是保持水土流失、防風固沙的“活鋼筋”，同時也是解決農牧業肥料、飼料、鄉村開展多種經營、增加收入、改良土壤的優良樹種。

叢枝菌根(arbuscular mycorrhizal fungi，AM)真菌是一種專性內共生真菌，可以和自然界中絕大多數植物形成互惠共生聯合體［2］，提高植株對環境生物和非生物脅迫的耐受力［3］，促進植物對養分的吸收。AM真菌還可以產生生理活性物質，調節植物生理代謝活動，對植物的成活、生長都起到促進作用。而紫穗槐根系發達，側根豐富，并且能與AM真菌形成很好的共生關系［4-6］，因此可作為AM真菌與木本宿主植物之間互惠共生關系的研究材料。

基因在表達過程中由于mRNA的選擇性拼接和修飾即轉錄后修飾，以及在翻譯成蛋白質的過程中經歷乙?；?、烷基化、糖基化等翻譯后修飾，轉錄水平所獲得的基因表達信息并不足以闡明基因的功能。而蛋白質是生物體的基本功能單位，也是基因功能的最終執行者，因此，從翻譯水平上研究基因的表達與功能，是生命科學發展的必然趨勢［7］。近年來，蛋白組學在后基因組時代快速發展起來，成為一個分析生物體或者組織內蛋白豐度和蛋白分布的有效工具，用來分析和鑒定不同組織蛋白表達特性以及進行目標蛋白的定位［8］。另一方面，蛋白質組學方法已經被用來研究被AM真菌侵染植物在鹽脅迫下蛋白質組變化以及AM真菌—宿主植物共生體系相關蛋白［9-10］。

為了研究紫穗槐菌根形成過程中蛋白質的變化，從蛋白質組水平初步揭示紫穗槐菌根共生體形成的分子機制，提取紫穗槐菌根總蛋白并建立2-DE體系至關重要［11］。但目前，有關紫穗槐菌根蛋白質組學方面的研究尚未見報道。雖然國內有很多學者已建立了其他植物根蛋白質組學的2-DE分離體系［12-14］，但由于不同植物在細胞結構、根蛋白含量以及色素、酚類、醌類、多糖等的含量和種類均存在差異［15］，目前還沒有一套體系能夠適用于所有植物。因此，根據紫穗槐根組織的特點，建立一套紫穗槐2-DE蛋白分離體系，是進行紫穗槐根蛋白質組學研究的前提。

蛋白質的提取有多種方法，目前常用于植物蛋白組學研究的根蛋白提取方法是TCA丙酮法及酚提取法［16-17］。本研究對比TCA丙酮法及酚提取法，優化出適于紫穗槐菌根蛋白的提取方法。然后對2-DE體系的菌根蛋白上樣量以及染色方法進行摸索，建立了一套適用于紫穗槐菌根蛋白的雙向電泳體系。以期為揭示紫穗槐菌根形成過程中特異蛋白的表達模式以及后續相關基因功能的研究奠定基礎。

1 材料與方法

供試AM真菌接種體為摩西球囊霉(Glomus mosseae，GM)，孢子含量約為1 630個/20 g，由黑龍江大學生態實驗室保藏;供試植株紫穗槐種子由吉林省林業科學研究院提供。

1.1 實驗設計

將紫穗槐種子先用溫水清洗表面，再用0.3%的高錳酸鉀浸泡3～4 h進行表面消毒處理，清水洗凈。將處理后的紫穗槐種子放入白瓷盤中，表面覆蓋濕潤白紗布，38℃下催芽，催芽期間適當補水保持種子濕潤。與此同時將V(草炭土)∶V(細沙)∶V(蛭石)=5∶2∶3混合配置栽培基質，用牛皮紙包起，121℃、0.1 MPa高壓蒸汽滅菌 2 h，取出自然晾干。將催芽后的紫穗槐種子種植在處理后的土壤中，并對其做以下處理：(1)非接種植株(CK)，即在滅菌后的基質中按每千克加入1 g滅活摩西球囊霉接種體，混合均勻;(2)接種植株(GM)，即在滅菌后的基質中按每千克加入1 g摩西球囊霉接種體，混合均勻。接種體由AM真菌的孢子、菌絲、菌根根段組成的根際混合物。

試驗在溫室盆栽條件下進行，每個處理重復15盆，隨機排列。日間溫度為25～30℃，夜間為18～20℃，相對濕度為60%～80%，光照16 h/d。每星期澆3次水。第15天開始取樣。用Phillip和Hayman的酸性品紅染色方法［18］檢測菌根侵染情況，取侵染率達90%的根樣進行如下試驗。

1.2 紫穗槐菌根蛋白提取

TCA法：將3 g根樣品用液氮研磨成粉末后，加入10 mL10%的TCA丙酮溶液和7μLβ-巰基乙醇，-20℃靜置45 min。20 000 g、4℃離心15 min，去上清留沉淀。向沉淀中加入10 mL丙酮和7μLβ-巰基乙醇，靜置1 h。20 000 g，4℃離心15 min，去上清留沉淀。沉淀用10 mL丙酮和7μLβ-巰基乙醇清洗至上清無色。將沉淀真空干燥，所得干粉-80℃保存備用。

酚提取法：將3 g根樣品用液氮研磨成粉末后，加入 10 mL 蛋白提取液(0.02 mol/L Tris、0.25 mol/L 蔗糖、0.01 mol/L EDTA、0.01 mol/L PMSF、0.01 mol/L DTT、1%TritionX-100)，研磨 15 min。再加入等體積Tris-飽和酚，繼續研磨5 min。然后20 000 g、4℃離心15 min，收集酚相于新的離心管中，向新管加入5倍體積0.1 mol/L的乙酸銨甲醇溶液，-20℃過夜。20 000 g、4℃離心15 min，去上清。最后用含0.07% β-巰基乙醇的丙酮洗滌至上清無色。將沉淀真空干燥，所得干粉置-80℃保存備用。

1.3 紫穗槐根總蛋白定量

使用GE公司的2D-Quant試劑盒(美國)對提取的總蛋白質進行定量分析。

1.4 蛋白質SDS-PAGE電泳初步檢測菌根共生相關蛋白

采用SDS-PAGE不連續系統進行蛋白質組分分析，分離膠濃度為12%，濃縮膠濃度為5%。將40μL蛋白樣品與10μL 5×Loading Buffer混勻后沸水浴5 min。取10μL上樣，電泳條件為：濃縮膠80 V;分離膠120 V。使用考馬斯亮藍R-350染色，熱染10 min。染色結束后用脫色液脫色至背景清晰為止。

1.5 雙向電泳分離紫穗槐菌根蛋白

試驗采用800μg和1 000μg兩種蛋白上樣量進行雙向電泳。用水化液將蛋白質樣品溶液定容至450μL，加入到上樣槽中。然后選用pH值4～7的24 cm IPG預制干膠條，進行第一向等電聚焦。第一向等電聚焦結束后，將膠條平衡，放到第二向玻璃板中。加入低熔點瓊脂糖封膠液，室溫靜置15 min后開始第二向電泳。電泳參數設定為：2 w/膠、電泳45 min;15 w/膠、電泳5～6 h;冷循環設定溫度為16℃。凝膠采用考馬斯亮藍R-250和考馬斯亮藍R-350染色。

1.6 凝膠圖譜掃描和分析

對脫色結束的聚丙烯酰胺凝膠進行掃描，分辨率為300 dp。用Gel-Pro analyzer軟件進行 SDSPAGE膠條帶分析，Image Master TM 2D Platinum(Version 7.0)進行雙向電泳圖譜分析。

2 結果與分析

2.1 雙向電泳體系的建立

SDS-PAGE優化蛋白質提取：紫穗槐為多年生落葉叢生小灌木，其遺傳特性和生物學特性都要比草本復雜，而且根部木質化較重，導致其根蛋白含量較葉片等部位低。常規的提取方法獲得的蛋白含量低，導致很多低豐度蛋白無法分離及分析，對后續的試驗研究造成很大的影響。試驗運用SDS-PAGE電泳對TCA法和酚提取法對菌根侵染率達到90%以上的紫穗槐菌根蛋白提取、比較，結果如圖1所示。

圖1 SDS-PAGE電泳圖

通過Gel-Pro analyzer軟件對電泳圖譜進行分析，結果表明A、B兩泳道未檢測到有效的條帶，C泳道檢測條帶數為24條，D泳道檢測條帶數為25條?？梢?，酚提取法與TCA丙酮法具有顯著的差異，蛋白條帶數目明顯多于TCA丙酮法。

將C與D泳道進行比較分析，其中出現3條表達量呈上升趨勢的蛋白條帶，圖中標示為3、4、5，分子量分別為 78.2、65.7、33.6 KDa;1 條表達量呈下降趨勢的蛋白條帶，分子量分別為27.0 KDa;2條特異蛋白條帶，圖中標示為2、6，分子量分別為15.7、21.3 KDa。從SDS-PAGE差異條帶可初步看出AM真菌與宿主植物共生后引起蛋白表達的變化。

蛋白質定量結果：通過GE公司2D-Quant試劑盒進行蛋白質定量，獲得蛋白標準曲線如圖2所示。

圖2 蛋白質標準曲線

根據蛋白標準曲線圖，計算酚提取法蛋白樣品質量濃度。接種滅活AM真菌處理組的蛋白質量濃度為21.62 g/L;接種摩西球囊霉處理組的蛋白濃度為26.49 g/L。蛋白濃度完全滿足雙向電泳24 cm膠條對蛋白質樣品的要求。

染色方法比較：蛋白質雙向電泳染色方法主要分為兩種：銀染和考馬斯亮藍染色。銀染靈敏度高，要求蛋白上樣量少，但大多數銀染方法與質譜不兼容［19］，常作為分析膠的染色方法?？捡R斯亮藍染色較銀染方法靈敏度低，要求較高的上樣量，但考馬斯亮藍染色方法與質譜兼容性強，主要用于制備膠染色，便于做蛋白質的質譜鑒定。試驗凝膠選用考馬斯亮藍R-250、R-350兩種染色方法分析。電泳條件為：上樣量1 000μg;第一向采用pH值4～7線性24 cm IPG膠條，第二向SDS-PAGE凝膠濃度為12%，結果如圖3所示。

圖3 紫穗槐根蛋白不同染色方法比較2-DE圖

經 Image Master TM 2D Platinum(Version 7.0)對兩塊凝膠分析，考馬斯亮藍R-250染色獲得426個蛋白斑點，考馬斯亮藍R-350染色獲得442個蛋白斑點。同時，考馬斯亮藍R-350染色后的凝膠膠塊背景較淺，蛋白質點之間邊界清晰。而且考馬斯亮藍R-350較考馬斯亮藍R-250染色還具有時間短，操作簡便的優點。

綜上所述，將考馬斯亮藍R-350染色方法作為2-DE體系的首選染色方法。

不同上樣量比較：過高的上樣量會造成很多高豐度蛋白掩蓋低豐度蛋白，從而丟失低豐度蛋白信息。而上樣量過低會使很多低豐度蛋白無法在凝膠圖譜中顯示出來，同樣會丟失低豐度蛋白信息，但低豐度蛋白往往是生命活動中起重要作用的功能蛋白［20］，同時也最有可能是在菌根共生的信號傳導中起關鍵性作用的信號因子。故選擇合適的上樣量對獲得分辨率高的凝膠圖譜至關重要。試驗選擇800 μg和1 000μg兩種上樣量，第一向采用pH值4～7線性24 cm IPG膠條，第二向SDS-PAGE凝膠濃度為12%，考馬斯亮藍R-350染色，結果如圖4所示。

圖4 紫穗槐根蛋白不同上樣量比較2-DE圖

經3次平行實驗，獲得重復性好的圖譜。上樣量1 000μg時檢測到的蛋白斑點數目與上樣量800 μg時檢測到蛋白斑點基本相同。但上樣量1 000 μg時檢測到的蛋白數量較多，且蛋白斑點多呈橢圓形，聚焦效果好，如圖4所示。本研究表明，紫穗槐菌根蛋白中含有大量低豐度蛋白，而且后續還要進行質譜操作，要求蛋白量大，故選用1 000μg作為后續試驗的參考上樣量。

2.2 紫穗槐根蛋白2－DE分析

采用優化后的2-DE體系對接種AM真菌紫穗槐侵染率90%以上時的菌根蛋白進行分析。凝膠圖譜經Image Master TM 2D Platinum(Version 7.0)軟件過濾背景，通過 Smooth、Min area、Saliency參數對凝膠圖像上的蛋白點進行對齊、點的匹配分析，結果如圖5所示。

圖5 紫穗槐菌根蛋白2-DE圖譜分析

經過3次重復分析可知接種滅活AM真菌處理CK組共獲得419個蛋白點，接種AM真菌處理GM組共獲得434個蛋白點。紫穗槐菌根蛋白雙向電泳圖譜表明AM真菌侵染率90%以上紫穗槐菌根蛋白質點的分子量范圍在14.4～96.0 kDa，但主要集中在14.4～66.2 kDa分子量范圍區域內，等電點范圍為 4.2～6.5。

通過 Image Master TM 2D Platinum(Version 7.0)軟件分析顯示，不同處理組蛋白共有32個蛋白點的表達豐度變化差異顯著(P＜0.05)。其中14個蛋白點上調表達，Sport number分別為：8、9、11、12、13、20、21、24、26、27、28、29、30、32;3 個蛋白點下調表達，Sport number分別為：1、18、19;15 個蛋白點僅在GM 處理組中表達，Sport number分別為：2、3、4、5、6、7、10、14、15、16、17、22、23、25、31。

3 結論與討論

SDS-PAGE結果表明，酚提取法蛋白條帶數目明顯多于TCA丙酮法，具有顯著的差異。本研究進一步優化了常規酚提取法，減少了實驗步驟，從而減少人為操作造成的蛋白量的損失;將紫穗槐根組織與提取液與Tris-飽和酚一同研磨并增加了研磨時間，使樣品破碎更完全，而加入提取液進行研磨又可以增加其與樣品蛋白的作用時間，使提取效果更佳。

針對與質譜兼容的考馬斯亮藍染色方法入手，本研究對R-350和R-250兩種染色法進行分析。結果表明，R-350染色后的凝膠膠塊背景較淺，蛋白質點之間邊界清晰。而且考馬斯亮藍R-350較考馬斯亮藍R-250染色還具有時間短，操作簡便的優點，故試驗選擇染色效果好的R-350作為2-DE體系的染色方法。

試驗選用800μg和1 000μg兩種常用蛋白上樣量。上樣量為1 000μg時檢測到的蛋白數量較多，蛋白斑點多呈橢圓形，聚焦效果好。在研究中發現紫穗槐含有大量低豐度蛋白，而后續質譜鑒定對蛋白含量要求比較大，故選用1 000μg作為后續試驗的參考上樣量。

采用優化的2-DE體系分析了紫穗槐菌根侵染率達90%以上的菌根蛋白。結果表明，在雙向電泳圖像上檢測到400多個蛋白點，其中上調表達蛋白點14個，下調表達蛋白點3個，特異表達蛋白點15個。

在AM真菌與植物互作的過程中，AM真菌作為外源真菌會誘導植物的防御反應［4，6］。一系列蛋白類激酶或者多肽類會參與到植物防御反應中［21-22］。因此推測上調的蛋白斑點可能與增加植株的抗逆性方面有關，抗逆性可以很好地保護宿主植物免受外源性侵害。而當AM真菌與宿主植物達成一致協議后，宿主植物會對有益內共生真菌-AM真菌打開防御門戶［23］，因此下調的蛋白斑點多肽可能為一些與防御性有關的蛋白。特異表達蛋白點可能為AM真菌蛋白，也可能是真菌與宿主植物之間的信號蛋白。這些差異表達的蛋白，均由AM真菌共生誘導，可能參與菌根形成過程的信號傳導，或者叢枝形成后的營養運輸，后續工作將對此加強研究。

基于雙向電泳膠的局限性，低豐度蛋白、堿性蛋白以及非極性的膜蛋白都不能在常規2-DE上分離出來［24］，因此本試驗分離出來的都是可溶性蛋白，其含量在植物體內代謝過程中的變化可以反映細胞內蛋白合成、變性和降解等方面的信息。在AM真菌同宿主植物互作后，宋鴿等［6］報道了接種AM真菌增加可溶性蛋白的含量，而且隨著菌根共生體的建立，產生一些新的蛋白［25］，原因可能是在AM真菌和宿主植物互作過程中，宿主植物細胞組織基因表達發生時空變換，某些基因(如共生相關基因、病程相關蛋白基因)會被誘導表達而產生相應的蛋白質，如參與防御的幾丁質酶基因，參與信號傳導的磷酸化底物，參與基因轉錄的轉錄因子，以及參與細胞形態改變的細胞骨架蛋白;同時又存在消失的蛋白，某些相關基因的表達會被抑制或推遲，甚至是原來的蛋白質被降解，以便附著泡、叢枝、泡囊、入侵栓等特征結構的形成，最后完成叢枝菌根真菌的內共生。

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