不同抗性楊樹接種潰瘍病菌后過氧化氫及其氧化酶的表達差異1)

馬 健

(國家林業局森林生態學與森林保護學重點實驗室(中國林業科學研究院森林生態環境與保護研究所)，北京，100091)

劉振宇 呂 全 梁 軍 嚴東輝 張星耀

(山東農業大學) (國家林業局森林生態學與森林保護學重點實驗室(中國林業科學研究院森林生態環境與保護研究所)

楊樹潰瘍病(Botryosphaeria dothidea(Moug.Ex，Fr.)Ces.＆ de Not.) 是 我 國 楊 樹 (Populus spp.)的重要枝干病害［1-3］。該病害近年來地理分布和寄主范圍不斷擴大，嚴重阻礙我國楊樹的發展。為了進一步控制楊樹潰瘍病，對于楊樹抗病信號轉導系統的研究是十分必要的。過氧化氫(Hydrogen peroxide，H2O2)作為植物抗病信號轉導系統中新組分的發現，使H2O2與植物抗病性的研究成為新的熱點。研究表明，H2O2可以作為第二信使誘導防御反基因的表達，從而使植物表現出抗性，是植物抗病反應中激活相關防御基因的主要信號分子［4-5］。隨著植物體內H2O2的積累，其清除系統中的抗壞血酸過氧化物酶(APX)和過氧化物酶(POD)等酶的活性也隨植物抗病性的不同而具有顯著差異。同時，理永霞等［3］對楊樹接種B.dothidea后蛋白質表達進行差異分析，發現楊樹接種潰瘍病菌后APX與POD差異表達，說明這兩種蛋白在植物防御應答中具有重要作用。為了進一步分析 H2O2、APX和POD在楊樹抗潰瘍病過程中的表達情況，筆者以抗病毛白楊(Populus tomentosa)和感病北京楊(P.×beijingensis)為研究對象，探討不同抗性楊樹接種潰瘍病菌后，H2O2及抗病相關酶活性變化與基因表達情況，以期為有關信號分子和抗性相關基因在預防楊樹潰瘍病上的開發利用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 供試楊樹、菌株及接種

以1年生毛白楊(Populus tomentosa Carr.，自然狀態下感病指數為0～6.0)和北京楊(P.×beijingensis W.Y.Hsu，自然狀態下感病指數 45.1 以上)［6-7］扦插苗為試驗材料，其扦插枝條采自中國林業科學研究院森林生態環境與保護研究所病理組實驗苗圃毛白楊和北京楊植株，扦插于中國林業科學研究院溫室，在相同的環境條件下，采用常規方法對苗木進行統一管理，盆栽用土為V(園土)∶V(草炭土)∶V(蛭石)=1∶1∶1，溫室中晝夜溫度分別為25～27℃和18～20℃，平均日照時間12 h。

供試菌株為從北京楊潰瘍病斑上分離并保存的楊樹潰瘍病(Botryosphaeria dothidea，經單胞培養鑒定，致病力中等)病原菌株。菌株在27℃條件下于PDA平板上暗培7 d，無菌條件下用滅菌打孔器在菌落邊緣取直徑為5 mm的菌餅作為接種體備用。

針刺菌餅接種：用75%乙醇擦拭消毒，用滅菌解剖針在楊樹莖部輕刺梅花型針眼，相距約3 mm，然后將有菌絲一面朝向針眼貼緊，外被濕滅菌藥棉并用保鮮膜包扎固定接種點。每樹種設2個處理：針刺接種滅菌PDA培養基(CK)、針刺接種潰瘍病菌。實施處理后0(無針刺)、6、12、24、48、72 和96 h分別取樣，每處理每時間點重復3次。取后迅速投入液氮中，并保存于-80℃冰箱中備用。

1.2 H 2 O2摩爾質量濃度的測定

參考Patterson等［8］的方法，稍有改動。取1 g樣品加5 mL冷丙酮磨成勻漿，12 000 r/min離心，上清液定容，反應液中含0.1 mL體積分數為20%TiCl4的濃鹽酸、0.2 mL濃氨水和1 mL上清液生成的過氧化物—Ti復合物，用丙酮洗3次，丙酮揮發后溶于3 mL 1 mol/L硫酸中，410 nm下測光吸收值，按同樣程序制H2O2標準曲線。

1.3 H2O2的亞細胞定位

H2O2細胞化學定位根據Bestwick等［9］的方法。取樣部位為離病斑0.5 cm處樹皮進行取樣，取樣時用鋒利的刀片取離苗木接種點周圍小于1～2 cm2的樹皮。把樣品放在新制備的5 mmol/L CeCl3中真空滲透1 h。前固定：把莖塊放在固定液(體積分數2%戊二醛+體積分數4%多聚甲醛)中，室溫固定1 h，并在4℃條件下過夜。固定后，莖塊用二甲砷酸鹽緩沖液(CAB)漂洗2次，每次10 min。后固定：把莖塊放存體積分數1%的四氧化鋨固定液中，固定45 min。固定后再用CAB緩沖液漂洗2次，每次10 min。脫水：吸去緩沖液，注入乙醇，逐級梯度脫水。浸透：把樣品放在氧化丙烯中浸透2次，每次20 min。包埋：逐步用Eponaraldite包埋樣品。然后無染色看片。透射電鏡加速電壓80 V，切片厚度50～100 nm。

1.4 酶活性測定

酶活性測定參考現代植物生理學實驗指南［10］中的實驗方法，稍有改動。

1.4.1 抗壞血酸過氧化物酶(APX)活性測定

接種后于各時段取樣品，參照Nakano等［11］的方法測定APX酶的活性，略作改進。取1 g樣品加入50 mmol/L磷酸緩沖液進行研磨，冷凍離心(12 000 r/rain，20 min)后，取上清液備用。3 mL的反應體系中含50 mmol/L磷酸緩沖液(pH=7.0，0.1 mmoL/L EDTA-Na2)，0.3 mmol/L AsA，0.06 mmoL/L H2O2和0.1 mL酶液。加入 H2O2后，立即在20℃下用分光光度計測定10～30 s內290 nm波長下吸光值。

1.4.2 過氧化物酶(POD)活性測定

參照Hammerschmid［12］的方法對各處理樣品的POD酶活性進行測定，每處理測定3次，以每克鮮質量每分鐘增加0.1個 OD值為酶活單位(U·min-1·g-1)。

將所獲各處理數據用SPSS 13.0軟件進行統計分析。

1.5 Real－time PCR 分析

1.5.1 總RNA的提取和cDNA第一鏈的合成

RNA提取試劑盒(Bioteke公司)提取樣品的總RNA，TaKaRa的反轉錄試劑盒反轉錄成cDNA，方法按照說明書進行。將所獲得的RNA和cDNA分別儲存于-80℃和-20℃的冰箱中備用。

1.5.2 RT－PCR 引物設計與篩選

利用軟件Primer 5.0設計熒光定量PCR引物，見表1。

表1 毛白楊和北京楊接種潰瘍病菌后APX和POD RTPCR分析所用引物

1.5.3 目的基因的RT－PCR擴增

以反轉錄獲得的cDNA稀釋20倍作模板，按下列組分配制PCR反應液(反應液配制在冰上進行)：SYER Premix Ex TaqTM(2×)12.5 μL，PCR Forward Primer(10 μM)0.5 μL，PCR Reverse Primer(10 μM)0.5 μL，ROX Reference Dye(50×)0.5 μL，模板 2.0 μL，H2O9.0 μL。

本次實驗使用TAKARA公司SYBR?Premix Ex Taq TM(Perfect Real Time)試劑。Real-Time PCR反應程序為：95℃預變性30 s;接下來是40個循環，95℃變性5 s，60℃退火34 s;每個樣品3次重復，PCR反應結束后進行熔解曲線分析。儀器：ABI 7500 Real-time PCR System。

2 結果與分析

2.1 不同抗性楊樹接種B.dothidea后H2O2摩爾質量濃度變化

2種不同抗性楊樹接種潰瘍病菌后，其體內H2O2摩爾質量濃度差異顯著，同時發現兩種楊樹在健康狀態下(CK)H2O2摩爾質量濃度變化不明顯，見表2。

表2 不同接種時間后潰瘍病菌對不同抗性楊樹中H2O2摩爾質量濃度的影響

接種B.dothidea后，抗病和感病楊樹H2O2摩爾質量濃度均先上升后下降，但變化幅度存在明顯差異。毛白楊H2O2摩爾質量濃度顯著高于北京楊，在接種后24～72 h時的H2O2摩爾質量濃度顯著高于北京楊。72h時，毛白楊達到最高峰(P＜0.000 1)，而北京楊48 h時達到高峰，H2O2摩爾質量濃度分別為 737.52 mol/g和 306.99 mol/g，比相應對照(CK)分別增加10.03倍和3.08倍，見表2。

2.2 H2O2細胞化學定位

為進一步研究H2O2的系統性產生，用CeCl3染色的細胞化學方法對楊樹韌皮部H2O2積累情況進行檢測，結果見圖1。當孵育液中不加底物CeCl3時，未能觀察到黑色顆粒狀沉淀(圖1A、D)，因此，本試驗中CeCl3沉淀顆粒多少以及著色深淺為H2O2摩爾質量濃度的真實反映。從圖1B、E可以看出，接種潰瘍病菌72 h時，在電鏡下明顯觀察到，抗病毛白楊細胞壁兩側有H2O2的積累，增加的沉淀顆粒主要位于細胞壁上(圖1C)，表明毛白楊接種潰瘍病菌后，顯著誘導了楊樹韌皮部細胞中H2O2的積累;與抗病毛白楊相比，感病北京楊中H2O2-CeCl3沉淀顆粒很少，與應用植物生理學方法測定H2O2摩爾質量濃度的結果保持一致。初步推測楊樹中H2O2可能被病原菌誘導系統性產生，且起源于細胞壁。

2.3 潰瘍病菌侵染楊樹后抗壞血酸過氧化物酶(APX)活性變化及APX基因的表達

2.3.1 APX 的活性變化

毛白楊在接種B.dothidea后，其體內APX活性呈升高變化趨勢(表2)，相對于對照(CK)升高幅度為33.91%～350.37%，72 h時達到最大值(708.39 U·min-1·g-1)，相對于對照(CK)增加 350.37%;隨后至接種96 h，毛白楊體內的APX活性下降，下降幅度為24.34%。北京楊接種后，APX活性與對照(CK)相比差異不明顯;而未接種潰瘍病菌的抗、感兩個品種APX活性在所測定時間內無顯著變化，始終維持在一個較低而平穩的水平(見表2)。

可知，楊樹接種B.dothidea后，其莖部APX活性升高的幅度、峰值的高低均與楊樹的抗性有關。

2.3.2 APX 基因表達

B.dothidea對毛白楊和北京楊的APX基因均有誘導作用，接種后不同抗性品種在同一時間點的誘導表達有顯著的差異(表3)。從表3可以看出，接種后抗病毛白楊各個時期APX基因的表達水平均明顯高于感病北京楊。毛白楊-潰瘍病菌互作中APX基因受潰瘍病菌誘導后表達上調，48 h表達量上調且達到最高(t=21.557，P=0.002)。而在北京楊—潰瘍病菌互作體系中APX基因也是上調表達，但是上調幅度顯著低于毛白楊。

圖1 用CeCl3染色的細胞化學方法對楊樹韌皮部H2 O2的檢測

表3 不同接種時間后潰瘍病菌對不同抗性楊樹中抗壞血酸過氧化物酶(APX)活性的影響

表4 接種潰瘍病菌后不同抗性品種中APX基因表達差異

2.4 潰瘍病菌侵染楊樹后過氧化物酶(POD)的活性變化及POD基因的表達

2.4.1 POD 活性變化

從表4可以看出，不同抗性楊樹接種潰瘍病菌后，POD活性均呈上升趨勢。毛白楊接種B.dothidea后，其體內POD活性與對照(CK)相比增加17.26%～166.15%;而北京楊接種后POD活性雖也呈上升趨勢，但是增加不顯著，POD活性相對于對照(CK)僅增加了5.13%～64.04%，且接種48 h后POD活性開始下降，直至趨于對照。

未接種B.dothidea的抗、感兩個品種POD活性在所測定時間內無顯著變化，始終維持在一個較低而平穩的水平。這說明楊樹感染潰瘍病菌后其莖部POD酶活的變化一定程度上反映了楊樹的抗病程度，POD的活性與楊樹抗病性呈正相關。

表5 不同接種時間后潰瘍病菌對不同抗性楊樹中過氧化物酶(POD)活性的影響

2.4.2 POD 基因表達

接種B.dothidea后，抗病毛白楊POD表達量相對于感病北京楊變化顯著。POD在毛白楊接種后表達量處于上調趨勢，12 h時表達量上升(t=3.834，P=0.004)，為對照的 6.41 倍;隨后 24 h 表達量下降，但48 h時表達量迅速上升并達到較高值(t=11.023，P=0.0001)，為對照的 7.47 倍，而后表達受到抑制，表達量逐漸降低。而在北京楊中POD的表達量變化處于下調趨勢，見表5。

表6 接種潰瘍病菌后不同抗性品種中POD基因表達差異

3 結論與討論

H2O2是植物與病原菌互作中最重要的活性氧物質［4］，在植物對病原菌的防御反應中，H2O2作為一種信號分子可以在病原菌侵染后迅速產生，植物體內H2O2的積累及之后的過敏性反應被認為是植物抵御病原菌入侵的標志之一［13-14］。

本實驗研究表明抗病毛白楊在接種B.dothidea后H2O2的摩爾質量濃度顯著高于感病北京楊，毛白楊接種后72 h時，H2O2摩爾質量濃度達到最大值，且兩種楊樹對照(CK)中H2O2摩爾質量濃度沒有顯著變化。這說明楊樹在受到病原菌入侵時，H2O2可能參與楊樹的抗病防御反應，推測H2O2摩爾質量濃度的調控對楊樹抗潰瘍病菌具有重要的作用，楊樹對潰瘍病的抗性與植株體內H2O2的快速積累有關。同時，本實驗還利用CeCl3沉淀法進一步觀察了亞細胞水平上H2O2分布和積累的動態變化，結果顯示，抗病毛白楊在接種后72 h時，細胞壁上有大量CeCl3沉淀，初步推測楊樹中H2O2可能被病原菌誘導系統性產生，且起源于細胞壁。

大量研究表明，在不同抗性的植物中，抗氧化酶表達量的增加與植物抗性有關。POD和APX是植物體內重要的氧化酶［15］，是植物防御體系的關鍵酶，在活性氧代謝等多種代謝途徑中起到關鍵作用［16-18］。這些酶的活性可間接反映植物體內活性氧的代謝變化，與植物抗病性密切相關。本研究表明，接種B.dothidea后抗病毛白楊H2O2摩爾質量濃度變化與APX、POD活性變化具有顯著相關性;而感病北京楊中H2O2的變化不明顯。這表明毛白楊在接種后體內H2O2的快速積累可能誘導了APX、POD活性的升高。通過RT-PCR分析表明，潰瘍病菌誘導了兩種互作體系中楊樹APX和POD基因的表達，研究結果說明APX和POD基因表達差異是由于B.dothidea侵染后引起的，抗病品種相對于感病品種變化顯著，APX和POD參與了楊樹的抗病過程。

另有研究表明，APX是一種重要的雙氧水脫毒化的酶［17］，Agrawal等［19］報道了水稻 APX 基因的表達受稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)誘導，并且推測APX可能在植物的抗病過程中起重要作用。Chen等［20］證明煙草的SA結合蛋白(SA binding protein，SABP)與CAT高度同源，SA與SABP結合后阻礙其CAT活性，提高H2O2水平;除了CAT以外，沈文飚等［21］研究證明APX對H2O2的親和力要大于CAT，通過抑制APX活性提高植物體內H2O2摩爾質量濃度，H2O2或其他活性氧物質可激活抗病途徑中抗病基因的表達。這些研究結果可能是本實驗中抗病毛白楊在接種前期，APX活性下降的原因之一，可能存在SA與APX結合的現象。同時，RT-PCR分析證明，接種后抗病毛白楊APX基因表達在6～24 h上調不顯著，推測此時SA與SABP結合，抑制APX活性，從而導致了72 h時H2O2摩爾質量濃度的激增。這說明APX與楊樹抗病過程是密切相關的，可能在楊樹防御應答中發揮重要的作用，但APX與CAT在楊樹與潰瘍病互作過程中誰起到主導作用，還需要進一步研究。

由此可見，不同抗性楊樹在對潰瘍病菌的防御反應中，其體內H2O2摩爾質量濃度、APX與POD酶活性及基因表達的變化規律與其樹種的抗性密切相關，H2O2的積累程度在楊樹抗病反應中具有重要的作用，但其作用的具體途徑及H2O2是否作為信號分子在楊樹—潰瘍病互作體系中作用尚需進一步研究。

［1］張星耀，駱有慶.中國森林重大生物災害［M］.北京：中國林業出版社，2003.

［2］蘇曉華，張冰玉，黃秦軍，等.我國林木基因工程研究進展和關鍵領域［J］.林業科學，2003，39(5)：111-118.

［3］理永霞，呂全，梁軍，等.楊樹接種Botryosphaeria dothidea潰瘍病菌后蛋白質表達差異分析［J］.南京林業大學學報：自然科學版，2011，35(4)：1-6.

［4］Averyanov A.Oxidative burst and plant disease resistance［J］.Frontiers in Bioscience，2009，1：142-152.

［5］Zhang W P，Jiang B，Lou L N，et al.Impact of salicylic acid on the antioxidant enzyme system and hydrogen peroxide production in Cucumis sativus under chilling stress，Zeitschrift fur Naturforschung c-a［J］.Journal of Biosciences，2011，66：413-422.

［6］楊俊秀，李武漢，符毓秦.等.抗潰瘍病楊樹種類的調查研究［J］.西北林學院學報，1990，5(4)：1-10.

［7］王穎，胡景江，朱瑋，等.楊樹潰瘍病寄主誘導抗病性的研究［J］.西北林學院學報，1996，11(1)：1-4.

［8］Patterson B D，Macrea E A，Ferguson I B.Estimation of hydrogen peroxide in plant extracts using titanium(IV)［J］.Analytical Biochemistry，1984，139：487-492.

［9］Bestwick CS，Brown I R，Bennett M H，et al.Localization of hydrogen peroxide accumulation during the hypersensitive reaction of lettuce cells to Pseudomonas syringae pv phaseolicola［J］.Plant Cell，1997，9：209-221.

［10］中科院上海植物生理所.現代植物生理學實驗指南［M］.北京：科學出版社，1999.

［11］Nakano Y，Asada K.Hydrogen peroxide is scavenged by acerbate-specific peroxidase in spinachchlop1asts［J］.Plant and Cell Physiology，1981，22：867-880.

［12］Hammersehmidt R，Nuckles E M，Kuc J.Association of enhanced peroxides activity with induced systemic resistance for cucumber to Colletectrichum lagenarium［J］.Physiological and Molecular Plant Pathology，1982，20：73-82.

［13］Harfouche A L，Rugini E，Mencarelli F，et al.Salicylic acid induces H2O2production and endochitinase gene expression but not ethylene biosynthesis in Castanea sativa in vitro model system［J］.Journal of Plant Physiology，2008，165：734-744.

［14］Pei Z M，Murata Y，Benning G，et al.Calcium channels activated by hydrogen peroxide mediate abscises acid signaling guard cells［J］.Nature，2000，406：731-734.

［15］Zhao Y，Peralta-Videa J R，Lopez-Moreno，et al.Kinetin increases chromium absorption，modulates its distribution，and changes the activity of catalase and ascorbate peroxidase in Mexican Palo Verde［J］.Environmental Science and technology，2011，45：1082-1087.

［16］Bonifacio A，Martins M O，Ribeiro C W，et al.Role of peroxidases in the compensation of cytosolic ascorbate peroxidase knockdown in rice plants under abiotic stress［J］.Plant Cell and Environment，2011，34：1705-1722.

［17］Pal S，Dolai S，Yadav R K，et al.Ascorbate peroxidase from Leishmania major controls the virulence of infective stage of promastigotes by regulating oxidative stress［J］.Plos One，2010，5(6)：e11271.

［18］Spanou C I，Veskoukis A S，Stagos D，et al.Effects of Greek legume plant extracts on xanthine oxidase，catalase and superoxide dismutase activities［J］.Journal of Physiology and Biochemistry，2012，68：37-45.

［19］Agrawal G K，Jwa N S，Iwahashi H，et al.Importance of acerbate peroxides OsAPX1 and OsAPX2 in the rice pathogen response pathways and growth and reproduction revealed by their transcriptional profiling［J］.Gene，2003，322：93-103.

［20］Chen Z，Silva H，Klessig D F.Active oxygen species in the induction of plant systemic acquired resistance by salicylic acid［J］.Science，1993，262：1883-1886.

［21］沈文飚，徐朗萊，葉茂炳，等.水楊酸對小麥葉片抗壞血酸過氧化物酶活性的抑制［J］.南京農業大學學報，1998，21(3)：126-128.