96-II喜樹葉片高頻率植株再生體系建立1)

董鳳麗 祖元剛 王慧梅

(黑龍江生態工程職業學院，哈爾濱，150025) (森林植物生態學教育部重點實驗室(東北林業大學))

喜樹(Camptotheca acuminata Decne.)為我國特有樹種，廣泛分布于長江流域及南方各省區。其生長速度快、冠形完美，材質優良，是良好的用材樹種及園林綠化樹種。該樹種因體內含有抗癌和抗逆轉錄病毒的生物堿：喜樹堿、10-羥基喜樹堿等而聞名，深受植物學界和醫藥學界的青睞。臨床上用于治療肝癌、胃癌、腸癌、膀胱癌卵巢癌、食道癌、早期白血病等，其療效顯著。但是由于喜樹堿在植物組織中含量低、尤其是在成熟的喜樹葉片中含量急劇下降［1］，且目前野生狀態下喜樹資源不穩定，隨著市場上喜樹堿需求量的增加，生產上消耗的喜樹也越來越多。因此開發優良品種、擴大栽種面積已勢在必行。

到目前為止，對喜樹的研究多集中在苗木的生長狀況，喜樹堿的藥理作用及合成，細胞懸浮培養獲得喜樹堿等方面，對喜樹的組織培養方面研究報道還很少。目前有關于利用喜樹的莖段［2-4］、莖尖［5-6］、種胚［7］等作為外植體建立再生體系的報道，而葉片的再生僅有一例報道［8］。

東北林業大學森林植物生態學教育部重點實驗室在1996年從美國引入喜樹新品種——96-II，并在我國南方栽種后達到引種目的。本研究從96-II喜樹離體培養入手，探討離體葉片再生條件，旨在建立高頻率葉片再生體系，為今后加速96-II喜樹的人工繁殖、藥用林培育及遺傳轉化提供一條新途徑。

1 材料與方法

植物材料為96-II喜樹無菌苗葉片。培養溫度為22～25℃，光/暗周期16/8 h，光照強度1 000～1 500 lx。繼代周期為30 d。

96-II喜樹無菌苗的獲得：剪取3 a生96-II喜樹新生、未木質化的莖段，每段含有1個側芽，用洗滌劑漂洗30 min，再經流水沖洗1 h后，于超凈工作臺內，將莖段在70%的乙醇中浸泡30 s，再用3%次氯酸鈉消毒5 min，期間不斷搖動，然后用無菌水漂洗3～5遍，用無菌濾紙吸干，接種在WPM+6-BA1.0 mg/L培養基中，置于培養室培養。25 d后，切取莖段葉腋處長出的新枝，接入繼代培養基中進行擴繁。

葉片愈傷組織誘導及分化培養基篩選：以WPM、MS和B5為基本培養基，將無菌苗葉片切成1.0 cm×1.0 cm大小，分別接種于附加不同質量濃度的6-BA、NAA和2，4-D培養基上，蔗糖3%，瓊脂0.7%，調節pH值5.9左右。每個組合重復處理3次，每次處理10葉片，30 d后將愈傷組織轉入分化培養基，誘導不定芽分化。根據愈傷組織誘導率和不定芽誘導率大小確定最適培養基。

愈傷組織誘導率=(誘導出愈傷組織的外植體個數/接種外植體的總數)×100%;

芽誘導率=(誘導出芽的外植體個數/接種外植體總數)×100%。

生根培養基篩選：切取96-II喜樹誘導出的1.5 cm以上的不定芽，接入附加不同質量濃度NAA及IBA的WPM生根培養基上，置于培養室內進行根的誘導。每個處理10個不定芽，3次重復。30 d后統計不定芽的生根情況，計算生根率，篩選出96-II喜樹根誘導最適培養基。

生根率=(生根幼芽個數/接種幼芽總數)×100%。

煉苗移栽：將煉苗3～5 d后的組培苗，移栽到消毒處理過的泥炭土和細沙混合的基質中(V(泥炭土)∶V(細沙)=1∶1)，30 d后統計成活率。

2 結果與分析

2.1 96-II喜樹葉片愈傷組織及芽誘導

2.1.1 不同培養基對葉片愈傷組織誘導效果的影響

應用WPM、MS和B53種基本培養基，并用6-BA1.0 mg/L+NAA0.5 mg/L激素組合進行誘導愈傷組織效果比較，結果見表1和圖1。研究表明，葉片培養在MS培養基上，生長受到抑制，不能利用培養基中的營養成分，逐漸死亡。MS培養基中鹽質量濃度高，96-II喜樹的葉片不能吸收利用，反而被毒害致死。即使能夠存活，葉片也干枯，生長明顯受到抑制。WPM培養基上葉片愈傷組織誘導率(97.6%)明顯高于在B5培養基(56.9%)。愈傷組織體積大，結構致密，分化率高。由此，確定WPM為誘導葉片愈傷組織的最佳基本培養基。

表1 3種培養基對葉片愈傷組織誘導的效果

圖1 不同培養基對葉片愈傷組織的誘導效果

2.1.2 不同激素組合對96-II喜樹葉片愈傷組織誘導和分化的影響

從表2可以看出，只有細胞分裂素與生長素同時使用時，葉片才能被誘導脫分化形成愈傷組織，但只有二者達到適合比例時所形成的愈傷組織才具有再分化出不定芽的能力。單獨施加6-BA時對96-II喜樹葉片誘導愈傷組織不起作用，只有同時加入生長素后才能誘導形成愈傷組織。加入NAA、2，4-D都能很好誘導形成愈傷組織，但2，4-D與6-BA組合時，無論2，4-D質量濃度高低，愈傷組織誘導率都很高，長勢快，但所形成的愈傷組織為白色，質地疏松，20 d后所形成的愈傷組織完全覆蓋了整個葉片，隨著培養時間的延長，愈傷組織表面會由白色轉為紅色，所形成的愈傷組織都不能分化出芽(圖2)。說明2，4-D作用較強，使愈傷組織一直保持脫分化狀態，很能轉入分化狀態。

當NAA與6-BA組合時，愈傷組織誘導率與二者的質量濃度都相關，且所形成的愈傷組織，綠色，結構致密，幾乎都能分化出芽。當6-BA質量濃度不變時，愈傷組織誘導率隨著NAA質量濃度升高而升高，愈傷組織的大小與NAA質量濃度也成正比。但是6-BA的質量濃度不與愈傷組織的體積成正比，6-BA為1.0 mg/L時愈傷組織形成明顯好于6-BA0.5 mg/L時，但是當質量濃度達到1.5 mg/L時，愈傷組織形成受到了抑制，形成較晚，且體積小。這是因為這種生長素與細胞分裂素的配比，不適合96-II喜樹葉片誘導愈傷組織。當NAA質量濃度達到0.5 mg/L時，所誘導的愈傷組織形成早，長勢好，體積大，所以認為6-BA1.0 mg/L+NAA0.5 mg/L 的組合好于其它組合。

當6-BA、NAA和2，4-D3種激素同時使用時，愈傷組織形成明顯快于其它激素的組合。但是當2，4-D質量濃度增高時愈傷組織呈現白色，分化率降低。當2，4-D質量濃度為0.1 mg/L時，誘導愈傷組織快，體積大，芽分化率很高。所以認為誘導葉片愈傷組織的最好的激素組合為6-BA1.0 mg/L+NAA0.5 mg/L+2，4-D0.1 mg/L。

表2 不同激素組合對葉片愈傷組織誘導和分化效果的影響

圖2 不同的激素組合誘導的96-II喜樹葉片的愈傷組織

2.1.3 激素6-BA對愈傷組織分化的影響

在研究中發現，愈傷組織在含有細胞分裂素濃度過高而生長素質量濃度過低的培養基上誘導分化，會形成過于細密的嫩芽，雖然提高了增值速度，但苗多而弱，降低了芽的質量，不適宜作為生根或移栽用苗，甚至還會出現抑制分化的情況。只有轉入沒有生長素，低水平的細胞分裂素的培養基上，才能分化，抽枝、展葉，形成叢生芽。將愈傷組織轉入含有不同質量濃度6-BA的培養基上，愈傷組織分化的情況見表3。當6-BA為0.2 mg/L時，苗健壯，但是分化率低;當6-BA0.8 mg/L時愈傷組織分化率高，但是芽的狀態弱小，不利于生根等其他用途;在6-BA1.0 mg/L時愈傷組織分化受到抑制，分化率低且芽弱小;當6-BA0.5 mg/L時，愈傷組織分化率高，且苗健壯。所以，確定6-BA為0.5 mg/L是誘導96-II喜樹愈傷組織分化最適合的激素質量濃度。

表3 不同6-BA質量濃度對愈傷組織分化及不定枝增值的影響

圖3 愈傷組織分化的再生苗

2.2 96-II喜樹根誘導

生長素對不定根的形成起關鍵性作用。在無激素的條件下，再生苗也能生根，但是生根率很低，只有33.3%，而且根的平均數量為2條。加入生長素后，生根狀況都有了改善。IBA和NAA在高質量濃度時都能很好的誘導生根，從表4可以看出生根率和平均生根數都分別隨兩種激素質量濃度的增加而增長。而且生根的質量也和兩種激素的質量濃度成正比。但從圖4中可以看出二者的生根效果不同，IBA誘導的根細長，均勻;NAA誘導的根粗壯，但生根較晚。IBA誘導生根的苗，在其基部直接生出根，莖中的維管組織與根中的維管組織直接相連，移栽后容易成活;NAA誘導生根的苗開始在莖的基部形成愈傷組織，然后在所形成的愈傷組織上生出粗壯的根。隨著NAA質量濃度的增高所形成的愈傷組織也增大，且根形成變晚。說明NAA先誘導莖基部脫分化，然后誘導愈傷組織分化生成根，這樣形成的根與莖之間并無維管組織的直接聯系，以致移栽后不能成活。從圖4看出，試管苗在IBA的誘導下植株生長正常，而在NAA的誘導下植株不生長，且葉片下垂。隨著NAA的質量濃度的增加，這種現象越明顯，說明NAA抑制了植株的生長。由此，可以確定最佳的生根的激素為IBA，質量濃度為0.8 mg/L。

表4 不同的激素種類及質量濃度對生根的影響

圖4 不同激素對生根誘導的影響

2.3 96-II喜樹煉苗和移栽

將組培苗根長為1～2 cm時，去掉封口膜，在陽光充足的溫室內，煉苗3～5 d，用自來水洗凈根部培養基，移栽到經消毒處理的混合的基質中(V(泥炭土)∶V(細沙)=1∶1)，在培養期間使用塑料膜小拱棚保溫、保濕。30 d后調查，96-II喜樹組培苗成活率為95%以上(圖5、6)。

圖5 生根的96-II喜樹再生苗

圖6 移栽的96-II喜樹組培苗

3 討論

本試驗通過對96-II喜樹無菌苗葉片離體培養，研究了不同基本培養基和不同質量濃度的激素配合使用對96-II喜樹葉片愈傷組織誘導途徑再生的條件。結果表明96-II喜樹愈傷組織誘導需要生長素與細胞分裂素配合使用，單獨使用6-BA不能誘導愈傷組織。2，4-D與6-BA配合對于誘導愈傷組織作用明顯，愈傷組織形成早，速度快，但所誘導的愈傷組織不具有分化能力。NAA與6-BA配合，隨著NAA質量濃度增加，愈傷組織誘導率明顯提高，且具有很高的分化潛力，但愈傷組織形成速度稍慢，所以配合低質量濃度的2，4-D能提高愈傷組織誘導速率，但2，4-D質量濃度過高，影響愈傷組織分化。所以篩選3種激素之間的質量濃度比例是很重要的。組培苗移栽前，必須經過外界環境馴化或鍛煉，才能適應外界的溫度、濕度和強烈的自然光照。所以在移栽前要先去掉封口膜，在陽光充足的溫室內，鍛煉小苗3～5 d，有利于提高組培苗移栽成活率。其間可適當增加光照強度，以提高小苗的木質化程度。

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