針康法對局灶性海馬缺血大鼠學習記憶能力及突觸素表達的影響

趙振峰，金翊思

腦卒中患者常出現學習記憶功能障礙，學習記憶障礙不僅影響患者的軀體功能恢復，也嚴重影響其生活質量。針康法是一種中西醫結合的綜合康復方法，廣泛在腦卒中康復中應用，能夠明顯提高腦梗死患者日常生活能力，改善認知功能[1-2]，降低腦水腫，促進室管膜下區神經干細胞的增殖和分化[3]。中樞神經系統可塑性是腦缺血后神經功能恢復的重要生物學基礎，突觸的重建是其關鍵步驟。突觸素P38是一種存在于突觸小泡膜上的鈣結合糖蛋白，參與囊泡的轉運和排放，突觸重建時其表達增多，是突觸重建的重要標記物，與學習記憶功能關系密切[3]。為此，本實驗通過觀察局灶性海馬缺血大鼠針康法干預后突觸素P38的變化情況，探討其對學習記憶能力影響作用機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及分組 健康清潔級雄性SD大鼠50只，體重200～250 g，由黑龍江中醫藥大學實驗動物中心提供(許可證號SCXK(京)2009-0001)。將大鼠隨機分為假手術組、模型組、頭穴叢刺組、康復組和針康組，每組10只。

1.2 試劑和儀器 虎紅粉劑(國藥集團化學試劑有限公司)；冷光源(哈爾濱工業大學)；Morris水迷宮(華北正華生物儀器設備有限公司)；Y-型迷宮(淮安市天劍工具廠)。

1.3 方法

1.3.1 模型制備 參照采用光化學法誘導法[4]：大鼠用10%水合氯醛按35 mg/kg腹腔注射進行麻醉后，將大鼠采取俯臥位放置在腦立體定位儀上，沿頭部正中切開大鼠頭皮暴露出顱骨，找到前囟點，在前囟點后3.5 mm、中線向左旁開2.0 mm處，用牙科鉆鉆開一個直徑約1 mm的骨窗，光纖管尾端至硬膜下3.3 mm。腹腔注射1.5%(生理鹽水稀釋)虎紅70 mg/kg，注射時間2 min。5 min后照射局部海馬組織5 min。術后縫合頭皮，正常喂養。模型成功后24 h進行干預。

1.3.2 干預方法 假手術組：不造模，常規麻醉，沿頭顱切開頭皮，用牙科鉆在前囟后3.5 mm、中線向左旁開2.0 mm處鉆孔，然后縫合頭皮。

模型組：造模后不進行任何處理，自然恢復。

頭穴叢刺組：參照華興邦等研制的《大鼠穴位針灸圖譜》，于造模后采用于致順頭部腧穴七區劃分法取頂區。針具選擇0.25×15 mm，進針3～10 mm，留針6 h。

康復組：造模后進行Morris水迷宮訓練，從平臺所在象限外的另外3個象限隨機選擇入水點，將大鼠面向池壁放入池中，記錄大鼠尋找并爬上平臺的時間，即潛伏期。如果大鼠2 min之內找不到平臺，則將其放在平臺上停留30 s后再放回籠中，此時潛伏期記為120 s。訓練時依次從3個不同的入水點入水，每次入水點相同，訓練的順序固定。此項主要訓練大鼠的學習記憶功能和游泳能力。每天訓練1次。

針康組：造模后進行頭穴叢刺法針刺法，并在留針期間進行Morris水迷宮訓練，每天1次。

1.3.3 學習記憶能力的評估 Y-型迷宮：為一個三等臂式迷宮，每臂頂端設一信號燈，相應臂的信號燈亮，此臂即為安全區，其余兩臂為危險區。訓練中始終有一臂為安全區，安全區按無規則的次序變換。如果大鼠在通電后從所在亮臂跑到另一亮臂記為正確，跑到暗臂則為錯誤。一天內連續分段訓練大鼠，每10次為1段，兩段間大鼠休息2 min。記錄大鼠掌握迷宮結構(續10次測試中有9次正確即為掌握迷宮結構)所需的訓練次數，訓練次數越少表明大鼠學習能力越強。

1.3.4 標本采集及指標檢測 治療14 d后，待大鼠檢測完行為學后灌注取材。按0.35 ml/100 g體重的劑量腹腔注射10%水合氯醛，待大鼠深度麻醉后，打開胸腔充分暴露心臟，灌注針刺入心尖，經左心室插管至主動脈，固定插管并剪開右心耳，灌注生理鹽水，直至右心耳流出澄清液體，再灌注4%多聚甲醛固定液200 ml。灌注完畢后，斷頭取腦，置于多聚甲醛中固定。24 h后常規乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，連續切片，厚度為5μm，采用免疫組化染色。

每張切片于10×40放大倍數下隨機選5個視野，統計每個視野內的突觸素陽性細胞數，凡顯色者均為陽性。

1.4 統計學分析 采用SPSS 17.0統計軟件進行統計學分析，計量資料以(±s)表示，組間差異采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Newman-Keuls法進行Q檢驗，顯著性水平α=0.05。

2 結果

2.1 學習記憶能力 Y-型迷宮實驗結果顯示，與假手術組比較，各組分辨學習能力下降(P＜0.05)。與模型組比較，頭穴叢刺組、康復組、針康組學習能力明顯恢復(P＜0.01)，且針康組優于頭穴叢刺組和康復組(P＜0.05)。

表1 各組大鼠不同時間點學習記憶能力比較

2.2 海馬突觸素的表達 局灶性海馬缺血灶周圍突觸素陽性細胞明顯增多，表現為神經元軸突、樹突、細胞體中褐色深染。其中軸突表達最為明顯。與假手術組比較，各組大鼠的突觸素表達明顯增加(P＜0.01)。與模型組比較，康復組、針康組表達明顯增加(P＜0.01)，且針康組明顯優于頭穴叢刺組和康復組(P＜0.01)。

表2 各組大鼠突觸素檢測結果

3 討論

突觸素是一種位于突觸囊泡膜上鈣結合蛋白，是突觸小泡特異性外側膜蛋白，幾乎所有中樞和周圍神經系統的突觸前終末內均發現有突觸素，在突觸囊泡轉運、排放及內容物釋放過程中都發揮著重要作用。P38既是突觸發生的標志[4-5]，又是突觸傳遞效能水平的反映[6]。P38除了影響突觸囊泡在前突觸末端的分布，還參與調節其他突觸生成時必需蛋白的生成，其機制可能是突觸素通過與肌動蛋白絲的結合，穩定突觸囊泡，從而阻止這些蛋白的降解，因此，突觸素的可能作用是作為介導突觸形成信號通路中的上游分子。

針康法促進局灶性海馬缺血大鼠學習記憶能力的機制可能有多種。電針結合運動療法可增加腦缺血中心區神經生長因子的表達[7]，促進海馬齒狀回巢蛋白陽性細胞增殖[8]。孔妍等研究認為，針康法能提高缺氧缺血性腦損傷幼鼠學習記憶能力，其分子機制可能與海馬CA1區海馬微管相關蛋白-2(MAP-2)陽性細胞表達增加有關[9]。趙振峰等將60例大鼠隨機分為假手術組，模型組，頭穴叢刺組，康復組，針康組，采用光化學法誘導法制作海馬缺血模型，分別在3d、7 d、14 d進行Y-型迷宮測試，并觀察血管基質細胞衍生因子(SDF-1)的蛋白及其mRNA表達水平，結果發現，針康法能上調局灶性缺血大鼠海馬SDF-1 mRNA表達，認為這可能是其促進灶性海馬缺血大鼠學習記憶能力提高的機制之一[10-11]。

本實驗結果顯示，局灶性海馬缺血大鼠在針刺結合康復訓練治療后P38表達增強，與模型組、頭穴叢刺組、康復組比較有顯著性差異(P＜0.05)。提示針康法能夠上調腦缺血后海馬區P38表達，進而改善學習記憶功能。表明針康法能明顯促進腦缺血大鼠神經功能和學習記憶能力的改善，可能與其促進海馬神經元突觸前囊泡的數量增加有關。

本實驗中針康組對腦缺血大鼠的學習記憶能力的改善，明顯優于單純的頭穴叢刺組或康復組。表明針灸這一傳統康復療法與現代康復相結合在短時間內，對于改善缺血大鼠神經功能和學習記憶能力優于其他療法。其機制可能與其針刺運動訓練促進局灶性海馬缺血大鼠患側海馬區P38蛋白表達有關。有實驗發現在阿爾茨海默病患者，突觸素免疫反應性在額葉皮質和海馬顯著減少，并且與認知功能損害呈負相關[12]，且動物實驗也報道突觸素表達水平與空間記憶能力密切相關，突觸素表達較高的動物在Morris水迷宮測試中的成績更好[13]。

由于突觸形成和再生是多種因素相互作用的結果，此過程受很多種蛋白、因子表達變化的影響。

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