大白菜褐腐病（莖基腐病）的病原菌鑒定

周慧敏 謝學(xué)文 石延霞 郭英蘭 李寶聚*

（1中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京 100081；2中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，北京 100101）

大白菜〔Brassica campestrisL. ssp.pekinensis（Lour）Olsson〕，屬十字花科（Cruciferae）蕓薹屬（Brassica）。主要分布于中國(guó)北方各地，供秋冬及春季食用，其中以華北地區(qū)栽培面積最大，其栽培面積和產(chǎn)量居各種蔬菜之首。但是隨著連作年限增加，大白菜生產(chǎn)中的病害在我國(guó)各大白菜種植區(qū)普遍發(fā)生，并呈現(xiàn)逐年加重的趨勢(shì)。

2011年1月對(duì)北京、河北、江蘇等地多個(gè)大白菜種植基地進(jìn)行病害調(diào)查，發(fā)現(xiàn)大白菜上普遍出現(xiàn)不同程度的莖基腐爛癥狀，當(dāng)?shù)厮追Q“莖基腐病”。病菌常自靠近地面的葉柄處侵入，嚴(yán)重發(fā)生時(shí)，60%～70%的大白菜莖基部有此癥狀，嚴(yán)重影響了大白菜的商品價(jià)值，給生產(chǎn)者造成了一定的經(jīng)濟(jì)影響。調(diào)查分析發(fā)現(xiàn)，造成該病害嚴(yán)重發(fā)生的主要原因是管理者對(duì)大白菜“莖基腐病”的發(fā)生規(guī)律和病原菌不了解，針對(duì)這一現(xiàn)狀，本試驗(yàn)對(duì)這些地區(qū)大白菜“莖基腐病”在病原菌分離的基礎(chǔ)上，進(jìn)行形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)鑒定和致病性測(cè)定試驗(yàn)，旨在為大白菜“莖基腐病”的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病樣采集及癥狀觀察

2011年1月在北京、河北、江蘇等地進(jìn)行大白菜病害發(fā)生情況調(diào)查，發(fā)現(xiàn)當(dāng)?shù)厮追Q的大白菜“莖基腐病”普遍發(fā)生，采集病樣標(biāo)本12份，并進(jìn)行病樣癥狀描述和照片采集。

1.2 病原菌的分離及形態(tài)學(xué)鑒定

用常規(guī)根腐病菌的分離方法（方中達(dá)，1998）進(jìn)行病原菌分離培養(yǎng)：在病樣莖基部病健交界處剪取10 mm2的組織塊，75%的酒精消毒30 s，無(wú)菌水漂洗3次，無(wú)菌吸水紙吸干，接種在PDA培養(yǎng)基上，25 ℃條件下培養(yǎng)2 d后，純化培養(yǎng)，菌種4 ℃下甘油中冷凍保存。分離到的菌株轉(zhuǎn)接到PDA培養(yǎng)基上，25 ℃黑暗條件下培養(yǎng)4 d，觀察菌落形態(tài)特征，并在顯微鏡下進(jìn)行觀察，拍照記錄。

1.3 分子生物學(xué)鑒定

1.3.1 DNA提取 形態(tài)學(xué)研究表明，分離得到的12個(gè)菌株培養(yǎng)特征和顯微特征均一致。隨機(jī)選取3個(gè)菌株轉(zhuǎn)接到PD液體培養(yǎng)基中，28 ℃震蕩培養(yǎng)7 d，無(wú)菌紗布過(guò)濾培養(yǎng)液，收集菌絲體，高壓抽濾后凍干，基因組DNA采用郭新梅等（2005）的改良CTAB法提取。

1.3.2 rDNA-ITS序列擴(kuò)增及測(cè)序 采用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTA TTGATATGC-3′）對(duì)分離物進(jìn)行 PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增反應(yīng)在 S1000 Thermal Cycler PCR儀（BIO-RAD）上進(jìn)行。反應(yīng)體系為 20 μL：4 μL10×PCR Buffer反應(yīng)緩沖液，2 μL 0.2 mmo1·L-1dNTPs，2 μL 10 μmo1·L-1的 1對(duì)引物，1 μL 250 ng模板 DNA，0.5 μL 5 UTaqDNA聚合酶和10.5 μL ddH2O。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性4 min；每個(gè)循環(huán)94 ℃變性1 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，最后在4 ℃停止反應(yīng)。產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳，goldview染色，經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)拍照。將擴(kuò)增的 PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序（測(cè)序單位：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所），將獲得的序列在GenBank的核酸序列庫(kù)中進(jìn)行同源性比對(duì)。

1.4 致病性測(cè)定

根據(jù)柯赫氏法則，采用貼菌片接種法對(duì)分離得到的菌株進(jìn)行致病性測(cè)定，致病性試驗(yàn)選擇在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所溫室中進(jìn)行。病原菌在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)4 d后，用打孔器打取直徑為0.5 cm的菌絲塊，貼到大白菜幼苗莖基部。每個(gè)菌株接種9株大白菜幼苗，設(shè)貼不含病原菌的PDA培養(yǎng)基塊的植株為空白對(duì)照。接種后植株保濕48 h，之后轉(zhuǎn)入26～32 ℃溫室中進(jìn)行培養(yǎng)，接種3 d后進(jìn)行病害發(fā)生情況調(diào)查，并自發(fā)病部位重新采集病樣進(jìn)行病原菌的分離和鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 病害癥狀及病原菌分離結(jié)果

2011年1月，北京、河北、江蘇等地大白菜種植區(qū)出現(xiàn)不同程度大白菜莖基腐爛癥狀，植株發(fā)病后，靠近地面的葉柄首先表現(xiàn)病癥，發(fā)病初期在葉柄上形成淺黃褐色或淺紫灰色小斑，病斑逐漸擴(kuò)大，呈黃褐色、紫灰色至暗褐色，橢圓形至不規(guī)則形，病斑表面凹陷，內(nèi)部組織腐敗軟化（圖1）。從發(fā)病植株上共分離純化得到12個(gè)菌株。

圖1 立枯絲核菌引起的大白菜“莖基腐病”田間自然發(fā)病癥狀

2.2 病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定

通過(guò)平板培養(yǎng)與顯微觀察表明，分離得到的12個(gè)菌株特征一致。25 ℃條件下，在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)4 d，菌落淺黃色，平均直徑為 （80.0±3.0）mm，菌絲稀疏，蛛絲狀，邊緣規(guī)則，初期菌落無(wú)色，后期逐漸變?yōu)闇\黃褐色至褐色，菌落表面產(chǎn)生深褐色的小菌核，菌核直徑1.5～5.0 mm。菌絲粗3.0～7.0 μm，分枝處縊縮，離分枝不遠(yuǎn)處形成一隔膜（圖2）。參考植物病原真菌學(xué)（陸家云，2000）和真菌鑒定手冊(cè)（魏景超，2004），病原菌形態(tài)學(xué)鑒定分離到的病原菌為立枯絲核菌（Mccabe et al.，1999）。

圖2 病原菌培養(yǎng)和顯微特征

2.3 ITS序列分析

用rDNA-ITS通用引物ITS1/ITS4對(duì)菌株R1、R7、R9基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，均得到大小為500～600 bp的單一片段（圖3）。將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。然后將獲得的3個(gè)菌株序列在NCBI上進(jìn)行 BLAST分析，與立枯絲核菌Rhizoctonia solani菌株的相似性為 99%～100%。結(jié)果表明，供試 3個(gè)菌株均為立枯絲核菌Rhizoctonia solani，以分離物R7序列為代表序列提交到 GenBank，獲得登錄號(hào)為JX137115。

2.4 致病性測(cè)定結(jié)果

3個(gè)菌株分別接種大白菜幼苗，7 d后植株表現(xiàn)出明顯的發(fā)病癥狀，發(fā)病初期產(chǎn)生水浸狀淺褐色略凹陷的小斑，進(jìn)一步擴(kuò)展形成橢圓形至不規(guī)則形凹陷壞死病斑，病斑淺褐色，壞死腐爛狀。接種癥狀與田間自然發(fā)病癥狀一致，對(duì)照植株生長(zhǎng)正常，無(wú)病害癥狀（圖4）。剪取病健交界處的發(fā)病組織進(jìn)行病原菌的重新分離鑒定，所有發(fā)病植株均能分離到接種病原菌，進(jìn)一步證明在北京、河北、江蘇地區(qū)發(fā)生的大白菜“莖基腐病”的病原菌為立枯絲核菌Rhizoctonia solani。

圖3 引物ITS1/ITS4擴(kuò)增菌株總DNA凝膠電泳圖

圖4 人工接種大白菜幼苗7 d后植株發(fā)病情況

3 結(jié)論與討論

大白菜在我國(guó)的栽培歷史悠久，北方各地廣泛種植，是我國(guó)廣大消費(fèi)者喜食的重要蔬菜。2011年，在北京、河北、江蘇等地的部分大白菜種植區(qū)，當(dāng)?shù)厮追Q的大白菜“莖基腐病”普遍且嚴(yán)重發(fā)生，引起大白菜莖基部腐爛，嚴(yán)重影響了大白菜的產(chǎn)量和品質(zhì)。在生產(chǎn)中由于對(duì)該病害的發(fā)生規(guī)律及病原情況不了解，導(dǎo)致無(wú)法進(jìn)行及時(shí)有效的防治。本試驗(yàn)通過(guò)形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)和致病性鑒定等手段對(duì)大白菜“莖基腐病”病原菌進(jìn)行鑒定，以期為該病害的防治和抗病育種奠定理論基礎(chǔ)。

對(duì)采集到的不同地區(qū)的病樣標(biāo)本經(jīng)病原菌分離鑒定和致病性檢測(cè)，并將傳統(tǒng)真菌形態(tài)學(xué)鑒定方法與現(xiàn)代分子生物學(xué)方法相結(jié)合，確定了在我國(guó)北京、河北、江蘇等地大白菜“莖基腐病”的病原菌為立枯絲核菌Rhizoctonia solani，該病害與大白菜褐腐病病原菌相同，屬同病異名。由立枯絲核菌引起的大白菜病害發(fā)生流行和造成的損失都較小，國(guó)內(nèi)外研究也相對(duì)較少（da Silveira et al.，2000；Zhang et al.，2009）。因此，命名存在較大差異，給病害的鑒定和有效防治造成了較大困難。李明遠(yuǎn)等（1986）將由立枯絲核菌Rhizoctonia solani引起的大白菜病害命名為大白菜立枯病，呂佩珂等（1992）將由立枯絲核菌Rhizoctonia solani引起的大白菜病害命名為大白菜褐腐病，張麗（2008）將由立枯絲核菌Rhizoctonia solani引起的甘藍(lán)病害命名為球腐病。立枯絲核菌Rhizoctonia solani是一類寄主范圍廣泛的土傳病原菌（Liu et al.，2011）。目前，國(guó)內(nèi)外已經(jīng)報(bào)道的寄主包括：水稻、棉花、高粱、茄子、馬鈴薯、甜菜、瓜類、甘藍(lán)等（Camporota ＆Perrin，1998；Botha et al.，2003；Atkinson et al.，2011）。

2011年，在北京、河北、江蘇的部分地區(qū)由立枯絲核菌引起的大白菜“莖基腐病”普遍嚴(yán)重發(fā)生，田間發(fā)病嚴(yán)重時(shí)，病株率高達(dá)90%以上，對(duì)生產(chǎn)造成了較大影響。本試驗(yàn)通過(guò)相關(guān)研究最終確定在北京、河北、江蘇等地俗稱大白菜“莖基腐病”的病原菌為立枯絲核菌Rhizoctonia solani，大白菜“莖基腐病”與大白菜立枯病、褐腐病均屬同病異名。

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