基于SSR分子標(biāo)記的栽培種茄子遺傳多樣性分析

孫源文陳鈺輝劉富中張映連勇

（農(nóng)業(yè)部園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

茄子（Solanum melongenaL.）在世界各地廣泛栽培，我國(guó)是世界第一茄子生產(chǎn)大國(guó)（FAO，2009）。我國(guó)作為茄子的栽培馴化起源地之一（Daunay et al.，2001），茄子品種類型繁多，種質(zhì)資源十分豐富。茄子不同品種資源在開(kāi)展度、株高、花冠色澤、果皮顏色、果形、單果質(zhì)量等農(nóng)藝性狀方面存在差異，而且不同性狀在不同材料之間表現(xiàn)出不同程度的多樣性（詹園鳳 等，2007；趙德新 等，2009；文林宏 等，2010；梁任繁 等，2011）。

關(guān)于茄子種質(zhì)資源遺傳多態(tài)性已有應(yīng)用AFLP（廖毅 等，2009）、RAPD（冉進(jìn) 等，2007；王秋錦 等，2007；陳杰 等，2008）、SRAP（房超 等，2011；李懷志 等，2011）及ISSR（毛偉海 等，2006）等分子標(biāo)記技術(shù)分析的相關(guān)報(bào)道，基本認(rèn)為茄子的遺傳基礎(chǔ)相對(duì)較狹窄。然而，由于各自的取材、標(biāo)記技術(shù)及分析方法不同，對(duì)資源材料的分類及其與地理來(lái)源的相關(guān)性存在很大的爭(zhēng)議。

SSR（simple sequence repeat）是建立在PCR 技術(shù)上的一種廣泛應(yīng)用的分子標(biāo)記，具有含量豐富、多態(tài)性高、共顯性等優(yōu)點(diǎn)。因其DNA樣本用量少、技術(shù)操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性和穩(wěn)定性好，在番茄（宋建 等，2006）、辣椒（羅玉娣 等，2006）、玉米（肖木輯 等，2006；母貴琴 等，2011）、黃瓜（穆生奇，2008）、馬鈴薯（段艷鳳 等，2009）、甘薯（趙冬蘭 等，2011）、水稻（楊文毅 等，2011）等作物遺傳多態(tài)性分析及遺傳連鎖圖譜構(gòu)建等方面的研究中廣泛應(yīng)用。本試驗(yàn)利用SSR分子標(biāo)記對(duì)34份商品果實(shí)性狀差異明顯、具有代表性和地理來(lái)源不同的栽培種茄子高代自交系進(jìn)行遺傳多樣性分析，希望為茄子分子標(biāo)記輔助育種提供進(jìn)一步的理論依據(jù)和實(shí)踐參考。

表1 34份供試茄子材料農(nóng)藝性狀和來(lái)源

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)以34份經(jīng)多年自交選育的農(nóng)藝性狀遺傳穩(wěn)定、地理來(lái)源不同的栽培種茄子高代自交系為供試材料（表1）。

茄子SSR引物序列參照Nunome等（2009）的引物，選取基本覆蓋茄子12條染色體的105對(duì)引物，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 果實(shí)性狀調(diào)查 34份供試材料于 2010年春季統(tǒng)一種植于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所廊坊試驗(yàn)基地溫室，每個(gè)材料種植 2行，每行6株，田間管理按常規(guī)方法統(tǒng)一進(jìn)行。按照《茄子種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)》（李錫香，2006）的記載標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)供試材料果實(shí)性狀（果形、果皮色、果萼色）進(jìn)行調(diào)查。

1.2.2 DNA提取 苗期取新鮮葉片5～10 g，利用改良CTAB法提取DNA。1.5 mL離心管中加入一片新葉（約0.2 g）液氮速凍研磨至細(xì)粉末，加700 μL CTAB在65 ℃水浴1 h；加入700 μL氯仿/異戊醇（24V∶1V）搖晃均勻，4 ℃ 12000 r·min-1離心10 min；吸上清液500～600 μL，加入800 μL預(yù)冷的無(wú)水乙醇輕輕顛倒混勻，4 ℃靜置抱團(tuán)；倒去乙醇，加入800 μL 75%乙醇清洗兩遍；50 ℃烘箱干燥1 h，加入100 μL雙蒸水緩沖液，充分溶解DNA沉淀后加入 2 μL RNaseA（10 mg·mL-1），37 ℃溫浴 10 min，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 PCR擴(kuò)增及標(biāo)記檢測(cè) 總反應(yīng)體系10 μL：模板DNA 100 ng（1μL），引物共0.6 μL，Green Master Mix 5 μL，ddH2O 3.4 μL。

擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性40 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，34個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min；4 ℃保存。

擴(kuò)增產(chǎn)物采用JY-JX5雙垂直電泳槽（186 cm×95 cm），在非變性聚丙烯酰胺凝膠（20%）和0.5×TBE緩沖溶液條件下電泳分離。AgNO3染色、觀察、拍照，統(tǒng)計(jì)條帶。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

1.3.1 果實(shí)性狀聚類分析 果實(shí)表型性狀數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化處理：果皮色中紫紅記為0，黑紫記為1；果形中圓形（包括圓球形、高圓形、扁圓形）記為0，筒形（包括長(zhǎng)筒形、短筒形）記為1；果萼色中綠色記為0，紫色記為1；產(chǎn)地來(lái)源國(guó)外記為0，國(guó)內(nèi)記為1。

統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)按 UPGMA（unweight pair group method using arithmetic averages）方法，采用NTSYS-pc version2.10e軟件進(jìn)行聚類分析。

1.3.2 SSR標(biāo)記聚類分析 SSR擴(kuò)增產(chǎn)物以0、1、9統(tǒng)計(jì)建立數(shù)據(jù)庫(kù)：在相同遷移率位置上，有帶記為1，無(wú)帶記為0，缺失記為9，根據(jù)不同分析軟件的格式要求做相應(yīng)的轉(zhuǎn)換（肖木輯 等，2006）。

按UPGMA方法，采用NTSYS-pc version2.10e軟件進(jìn)行聚類，獲得樹狀圖；群體內(nèi)某一位點(diǎn)的等位變異數(shù)和有效等位基因數(shù)、Shannon’s信息指數(shù)統(tǒng)計(jì)等用Popgene軟件進(jìn)行分析計(jì)算（任小平 等，2010）；每個(gè)SSR位點(diǎn)的多態(tài)性信息量（Polymorphism information content，PIC）按公式PIC=1-∑fi2計(jì)算，其中fi為i位點(diǎn)的基因頻率（趙永鋒 等，2011）。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果

本試驗(yàn)利用已公布的105對(duì)茄子SSR引物，對(duì)34份茄子供試材料基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)和凝膠電泳檢測(cè)，其中79對(duì)SSR引物在34份材料中共擴(kuò)增出307個(gè)序列片段，譜帶在100～800 bp之間（圖1）。79對(duì)SSR引物中最少的可擴(kuò)增出1條譜帶，最多的可擴(kuò)增出12條譜帶，平均每對(duì)引物擴(kuò)增出4.55條譜帶，也說(shuō)明這79對(duì)SSR引物能夠用于本試驗(yàn)茄子材料的遺傳多樣性分析。

圖1 引物SSR022擴(kuò)增結(jié)果

2.2 多態(tài)性信息分析

通過(guò)Popgene軟件對(duì)篩選出的79對(duì)SSR引物所建數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示其中47對(duì)具有效多態(tài)性信息含量，共有148個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，位點(diǎn)多態(tài)性達(dá)到80.87%，有效等位變異所占比重為77.13%。這47對(duì)引物共含有214個(gè)等位基因（表2），等位基因的平均值約為4.55個(gè)，變幅2～12個(gè)。其中含有等位基因數(shù)最多是SSR003，共有12個(gè)等位基因，其次是SSR022和SSR001，為10個(gè)，SSR015為9個(gè)，SSR014和SSR139為8個(gè)；但有效等位基因（Ne）的平均值約為3.50個(gè)，變幅為1.0261～11.0295，其中SSR003、SSR022、SSR139含有的有效等位基因最多；每個(gè)標(biāo)記的多態(tài)性信息含量（PIC）的平均值為 0.582800，變幅為 0.025436～0.909334，最高為SSR003，其次為SSR022、SSR139、SSR014；標(biāo)記的基因型多樣性指數(shù)（H）平均值為0.9898，變幅為0.0310～2.2034，SSR003和SSR022最高；Shannon’s信息指數(shù)（I）的平均值為1.2795，變幅為0.0810～3.1563。

標(biāo)記的多態(tài)性信息含量（PIC）值基本與等位基因變異數(shù)目相對(duì)應(yīng)，即等位基因變異較多的SSR引物一般都具有較高的多態(tài)性信息含量（PIC）值；本試驗(yàn)中 PIC＞0.5的引物有32對(duì)，0.25＜PIC＜0.5的引物有9對(duì)；PIC＜0.25的引物有6對(duì)。由以上數(shù)據(jù)分析可知，本試驗(yàn)聚類分析中遺傳多態(tài)性較高的引物僅占全部的約30%，合適引物較少，多態(tài)性位點(diǎn)不足，可能無(wú)法將材料完全區(qū)分，也說(shuō)明供試材料遺傳多態(tài)性不高，遺傳背景較狹窄。

2.3 聚類分析

2.3.1 基于果實(shí)表型性狀的聚類分析 從果實(shí)表型性狀聚類樹狀圖（圖2）可知，供試材料遺傳相似系數(shù)在0.30～0.75之間，平均值為 0.52。在遺傳相似系數(shù) 0.30處材料可分為兩個(gè)大類群，即Ⅰ圓茄包括20份材料，Ⅱ長(zhǎng)茄包括 14份材料，符合率達(dá)到100%；在遺傳相似系數(shù)0.375處，圓茄類群分為a，b兩個(gè)組群，a為果皮黑紫色組群，b為果皮紫紅色組群；長(zhǎng)茄類群分為 c，d兩個(gè)組群，c是果皮黑紫色組群，d是果皮紫紅色組群。每個(gè)組群在遺傳相似系數(shù)0.508處都可劃分為2個(gè)小群，圓果形、果皮黑紫色、萼片紫色的國(guó)內(nèi)材料主要集中在a-1群中，長(zhǎng)茄則分布在 c-1、c-2和 d-2群中。樹狀圖表明根據(jù)果實(shí)表型性狀能將供試材料進(jìn)行粗略分類。

2.3.2 基于SSR標(biāo)記的聚類分析 依據(jù)79對(duì)SSR引物的條帶信息建立數(shù)據(jù)庫(kù)，由 NTSYS-pc version2.10e軟件進(jìn)行聚類，獲得樹狀圖。由聚類樹狀圖（圖3）可以看出，供試材料遺傳相似系數(shù)在0.63～0.93之間，供試材料之間的遺傳差異不大，遺傳基礎(chǔ)相對(duì)狹窄。在遺傳相似系數(shù)為0.63時(shí)，34份茄子材料可以分為兩大類群。第I類群包括15份材?料，果實(shí)形狀為圓形、果皮黑紫色、萼片紫色，來(lái)源于河北、天津、山西及河南；第Ⅱ類群包含19份材料，果實(shí)形狀多為筒形。第Ⅱ類群材料在遺傳相似系數(shù)0.75處可以分為Ⅱ-1和Ⅱ-2兩個(gè)小組，Ⅱ-1小組包括6份供試材料，遺傳相似系數(shù)變幅為0.75～0.85，果實(shí)形狀為高圓或筒形，果皮紫紅色，萼片多數(shù)為紫色，主要是來(lái)自國(guó)內(nèi)的材料；Ⅱ-2小組包括 13份材料，遺傳相似系數(shù)變幅為 0.79～0.93，果實(shí)形狀從高圓到長(zhǎng)筒均有，果皮黑紫色，萼片紫或綠色，全部來(lái)源于國(guó)外?；赟SR標(biāo)記的聚類分析結(jié)果顯示，利用SSR標(biāo)記能將供試材料進(jìn)行詳細(xì)分類，材料主要依果形歸類，與地理來(lái)源有一定的相關(guān)。

表2 34份茄子材料的SSR標(biāo)記的等位基因數(shù)、有效等位基因和遺傳多樣性指數(shù)

圖2 34份茄子材料基于果實(shí)表型性狀聚類分析圖

圖3 34份茄子材料基于SSR分子標(biāo)記聚類分析圖

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)105個(gè)SSR標(biāo)記進(jìn)行篩選，得到79個(gè)多態(tài)性標(biāo)記，但只有47個(gè)標(biāo)記在供試材料中具有多態(tài)性信息含量，且利用此47個(gè)標(biāo)記構(gòu)建的樹狀圖與79個(gè)標(biāo)記構(gòu)建的樹狀圖基本相同，逐漸增多標(biāo)記，樹狀圖基本不再發(fā)生變化，此結(jié)果說(shuō)明，豐富有效的SSR標(biāo)記是將試驗(yàn)材料區(qū)分開(kāi)的基礎(chǔ)，構(gòu)建茄子遺傳圖譜，對(duì)特定性狀進(jìn)行定位，有助于區(qū)分不同茄子品種。

供試材料遺傳相似系數(shù)在0.63～0.93之間，平均值0.78，說(shuō)明多數(shù)材料間具有一定的遺傳差異，但總體供試材料遺傳基礎(chǔ)相對(duì)比較狹窄，這與毛偉海等（2006）、冉進(jìn)等（2007）用其他標(biāo)記分析茄子材料遺傳多樣性結(jié)果相似。進(jìn)一步說(shuō)明育種中常用的茄子高代自交系的遺傳相似性很高，遺傳基礎(chǔ)非常狹窄，也說(shuō)明茄子品種選育的親本材料非常有限。因此，在茄子育種中廣泛收集和創(chuàng)造新的種質(zhì)資源，積極引進(jìn)國(guó)外優(yōu)異種質(zhì)資源，挖掘優(yōu)良基因，擴(kuò)大我國(guó)茄子育種的種質(zhì)資源基因庫(kù)，對(duì)提高我國(guó)茄子育種有重要意義。

基于分子標(biāo)記或農(nóng)藝性狀聚類分析栽培種茄子分類的有許多報(bào)道，本試驗(yàn)中供試材料依據(jù)SSR標(biāo)記和果實(shí)表型性狀的聚類分析可將供試材料分為兩大類，即圓茄和長(zhǎng)茄，這與傳統(tǒng)的Bailey（1929）和 Hara（1944）的茄子分類系統(tǒng)基本吻合。從二者樹狀圖對(duì)比可知，基于 SSR標(biāo)記的聚類分析較基于果實(shí)表型性狀的聚類分析，劃分得更詳細(xì)，能更準(zhǔn)確地反映種質(zhì)的遺傳基礎(chǔ)。從本試驗(yàn)聚類結(jié)果看，基本可以按照果實(shí)農(nóng)藝性狀和來(lái)源大體進(jìn)行歸類，這可能與本試驗(yàn)供試材料的選擇有關(guān)，材料主要來(lái)自北方地區(qū)及國(guó)外引進(jìn)栽培種的茄子高代材料，來(lái)源地較為集中且果實(shí)性狀和顏色變異較少。少數(shù)高圓果形材料（5、6、9、19、20號(hào)）被歸類到Ⅱ類群長(zhǎng)茄大類群，原因可能是沒(méi)有篩選到合適的引物，導(dǎo)致這幾份材料無(wú)法分開(kāi)。本試驗(yàn)部分供試材料為國(guó)外引種，但其與我國(guó)材料的遺傳相似性較高，這可能與地區(qū)、國(guó)家之間的種質(zhì)交流頻繁導(dǎo)致品種間遺傳相似性增高有關(guān)；其次可能是利用分子標(biāo)記多態(tài)性數(shù)據(jù)進(jìn)行遺傳多樣性分析，必須要有足夠的多態(tài)性位點(diǎn)，且這些位點(diǎn)能夠盡量均勻覆蓋整個(gè)基因組，而針對(duì)本試驗(yàn)標(biāo)記位點(diǎn)分析結(jié)果表明，其未能均勻覆蓋整個(gè)基因組。因此進(jìn)一步開(kāi)發(fā)篩選多態(tài)性信息量較高的 SSR分子標(biāo)記，構(gòu)建茄子遺傳連鎖圖譜，對(duì)分子標(biāo)記技術(shù)在茄子育種中的應(yīng)用更具實(shí)際意義。

本試驗(yàn)利用SSR標(biāo)記從分子水平上分析了茄子高代材料的親緣關(guān)系，可以根據(jù)本結(jié)果在保證達(dá)到育種目標(biāo)的前提下，在育種時(shí)選用不同類群的自交系配制組合，避免育種過(guò)程中出現(xiàn)遺傳背景狹窄、變異度降低等問(wèn)題，進(jìn)而可以減少親本選擇、選配的盲目性，大大提高育種效率。

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