犬／細／小／病／毒／性／腸／炎／的／診／斷

雷程紅，趙文年，樊紅春，龔曉偉，李新鵬，馬 林

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，新疆 烏魯木齊 830052）

犬細小病毒性腸炎，以劇烈嘔吐、腹瀉和白細胞顯著減少為其臨床特征，病初發(fā)熱，精神沉郁，不食，嘔吐，腹瀉，隨著病情的發(fā)展，糞便由稀狀變?yōu)榭Х壬蚍厌u色樣的血便并帶有特殊的腥臭氣味。該病發(fā)病率高，如果得不到正確診斷和及時治療，死亡率也高。最近，烏魯木齊市寵物犬發(fā)生疑似細小病毒性腸炎流行，我們結合臨床表現(xiàn)，采用兩種方法對該病進行了診斷，并對這兩種方法做了比較。

1 材料與方法

1.1 材料 病料，采集以嘔吐、腹瀉為臨床表現(xiàn)的寵物犬的糞便，共68例。豬紅細胞，采集6～8月齡健康豬全血。犬細小病毒單克隆抗體，購自北京世紀元亨動物防疫技術有限公司。犬細小病毒檢測試紙，購自韓國安捷公司。96孔90°V型微量反應板，微量加樣器和吸頭，1.5mL離心管，微量振蕩器，常用冰箱，溫箱，搖床，離心機。

1.2 方法

1.2.1 檢測試紙法 按照說明書進行，即：用棉簽收集犬糞，將棉簽浸入裝有1mL反應緩沖液的樣品收集管中，充分混勻，將混合液4滴緩慢地加到試紙上的樣品孔中，5～10min內(nèi)判定結果。

1.2.2 HA－HI法

1.2.2.1 糞便處理 用棉簽收集犬糞，放入無菌的裝有1mL生理鹽水的小離心管內(nèi)，反復涮洗幾次后棄去棉簽。將糞便樣品反復凍融3次，13000r／min離心10min，吸取上清液放入另一無菌小離心管內(nèi)，加入1／10體積的氯仿抽提混勻，3000r／min離心10min，液體分為兩層，小心吸取上層液體即為待檢樣品，－20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.21 %豬紅細胞懸液制備 無菌采集豬全血放入阿氏液中，血與阿氏液的比例為1∶9，迅速輕輕混勻，用10～20倍的生理鹽水洗滌3～4次，每次2000r／min離心5min，再用0.2mol／L，pH 值7.2的PBS洗滌1次，2000r／min離心5min。棄上清液體，用0.2mol／L，pH 值7.2的PBS將紅細胞配制成1%豬紅細胞懸液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.3 醛化紅細胞制備 見郭鑫［1］和符子華［2］的方法。

1.2.2.4 HA－HI方法 見秦海斌等人［3］的方法。即：在96孔板中進行操作。用生理鹽水倍比稀釋處理好的糞便樣本25μL至第11孔，第12孔做陰性對照，每孔加1%豬紅細胞懸液25μL，振蕩混勻后4℃靜置3h后讀取結果。以使豬紅細胞100%凝集的最高稀釋倍數(shù)為樣本中病毒液的紅細胞凝集效價。以該凝集效價配4單位病毒，用生理鹽水稀釋犬細小病毒單克隆抗體25μL至第10孔，第11孔做紅細胞對照，第12孔做抗原對照，加4單位病毒25μL，振蕩混勻之后放置37℃溫箱作用30min，每孔加入1%豬紅細胞懸液25μL，振蕩混勻后4℃靜置3h后讀取結果。

2 結果與分析

2.1 試紙法的檢測結果 檢測的68例糞樣均為陽性，即68例病犬都是犬細小病毒性腸炎。

2.2 HA－HI的結果 68個樣本中，63個的效價大于或等于1∶16且能被犬細小病毒單克隆抗體所抑制，為陽性，其余5個為陰性，陽性率為92.6%。檢測結果見表1。

表1 檢測試紙法和HA－HI診斷犬細小病毒結果

2.3 兩種方法的比較 從檢測結果看，試紙法的敏感性比HA－HI高，但特異性低；HA－HI的特異性高但敏感性低，兩者的陽性符合率為92.6%。

3 討論

3.1 試紙法是目前寵物門診最常采用的診斷方法［4］，其原理是免疫層析，即待檢糞樣（抗原）加到試紙條一端的樣本墊上，通過毛細作用向前移動，遇到結合墊上的金標抗體后互相反應，再移動至固定的抗體區(qū)域與之結合而被截留，聚集在檢測帶上，出現(xiàn)肉眼可見的顯色結果。該法敏感性高、簡單快速方便。我們用該法診斷68例病犬，其結果全部為細小病毒病，這與發(fā)病犬的臨床表現(xiàn)基本相符。

3.2 HA－HI是檢測犬細小病毒病的國標方法［5］，其原理是犬細小病毒有凝集豬紅細胞的能力，這種凝集能力又可被犬細小病毒特異性抗體所抑制。該法特異性高。我們用該法診斷68例病犬，其結果是63例為細小病毒病，這與發(fā)病犬的臨床表現(xiàn)也相符。

3.3 兩種方法的檢測結果中有5例結果不相符，其原因何在？分析試紙法，其假陽性是人為因素或是試紙本身造成國內(nèi)有關這方面的報道很少，我們對這不相符的5例糞便采用離心處理后又用試紙法檢測1次，結果4例為陰性，1例仍然是陽性。這說明造成假陽性結果的原因可能是糞便中的其他成分與試紙中抗體發(fā)生非特異性結合所致。分析HA－HI，其假陰性可能與腸道內(nèi)出現(xiàn)犬細小病毒抗體有關［6－7］，也可能與樣品的處理、操作及加樣的準確、器材的干凈、溶液的無菌等多種人為因素有關［1］。

3.4 上述兩種方法在臨床診斷中各有優(yōu)缺點，從快速簡便來看，選擇試紙法較好，因為試紙法操作步驟少，耗時幾分鐘，而在HA－HI試驗中，步驟多，耗時3～4h，且新鮮紅細胞需要不斷采集和制備，很不方便；從結果的準確性看，選擇HA－HI方法較好，因為該法的特異性比試紙法的要高。

4 結語

4.1 這次在寵物犬中流行的是犬細小病毒性腸炎。

4.2 HA－HI方法檢測時間較長，影響因素比較多，但經(jīng)濟實惠；目前門診上普遍采用的試紙法，方便快捷，只要對糞便事先處理，其假陽性會降低。

4.3 要得到準確的臨床診斷結果，最好同時采用這兩種方法來互補。

［1］ 郭鑫.動物免疫學實驗教程［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)大學出版社，2007：55.

［2］ 符子華.用醛化豬紅細胞進行犬細小病毒HA和HI試驗［J］.新疆農(nóng)業(yè)科學，1993（3）：133－134.

［3］ 秦海斌，張匯東，繆勤，等.犬細小病毒血凝的檢測和血凝抑制試驗方法的優(yōu)化［J］.中國比較醫(yī)學雜志，2009，19（7）：49－52.

［4］ 吳潔，劉強，侯宇成，等.新疆石河子市犬細小病毒病流行病學調(diào)查［J］.北京農(nóng)業(yè)，2011（15）：80－82.

［5］ 史利軍，曾妮，李剛.犬細小病毒生物學特征及檢測技術研究進展［J］.動物醫(yī)學進展，2010，31（4）：82－85.

［6］ 夏咸柱，李六金，武德麗，等.犬細小病毒性腸炎的診斷研究－犬細小病毒血凝和血凝抑制試驗［J］.中國人民解放軍獸醫(yī)大學學報，1983，3（2）：144－148.

［7］ 賈補年.犬細小病毒的電鏡和免疫電鏡觀察［J］.家畜傳染病，1983（3）：11－13.