地塞米松對肺纖維化小鼠細胞因子及羥脯氨酸的影響

史可云,謝 婧

(江蘇省宜興人民醫院內科,江蘇宜興,214200)

特發性肺纖維化(IPF)是一種由免疫介導的炎癥性疾病。近年來的研究表明,細胞因子的紊亂與肺間質纖維化有密切關系。多數研究者認為,炎癥細胞和細胞因子在間質性肺炎的發生發展過程中發揮著重要的作用。多種細胞因子形成復雜的細胞因子網絡,通過影響肺泡上皮細胞和間質成纖維細胞的增殖和凋亡,使細胞外基質的沉積增多,抑制纖溶系統的激活等多種途徑,最終促使肺纖維化持續進展[1-2]。作者觀察了地塞米松對BLM致肺纖維化小鼠血清中IFN-γ、IL-4、TNF-α含量的影響及羥脯氨酸的變化,以揭示細胞因子和羥脯氨酸在肺纖維化形成過程中的意義,對肺纖維化的治療作用及其可能機制,為臨床治療肺纖維化提供一條新的途徑。

1 材 料

清潔級小鼠30只,雌雄各半,體質量(25±1.2)g;購自江蘇大學實驗動物中心;地塞米松品購自SIGMA公司;鹽酸博萊霉素購自浙江海正藥業股份有限公司;小鼠 IFN-γ、IL-4、TNF-α ELISA試劑盒購自武漢博士德生物工程公司;羥脯氨酸(HYP)試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

2 方 法

2.1 動物分組及動物模型的制備

昆明小鼠隨機分為:空白對照組、博萊霉素(BLM)組、地塞米松(DXM)組,每組10只。用氣管內注入BLM(5 mg/kg)制肺纖維化模型,空白組除外。從造模次日開始,空白對照組、BLM 組分別每天灌胃生理鹽水(1 mL/kg),地塞米松(DXM)組每日灌胃地塞米松(0.45 mg/kg)。

2.3 測定血清中IFN-γ、IL-4、TNF-α的含量

治療第14天和第28天各組隨機分別取5只小鼠,心臟取血處死,分離血清,采用ELISA試劑盒法進行檢測。

2.4 羥脯氨酸(HYP)含量測定

精確稱取肺組織濕重40 mg放入試管中,準確加水解液1 mL,混勻,置入玻璃磨口試管中加蓋后沸水水浴水解20 min,水解10 min時混勻1次。調pH值至6.0～6.8。將各試管流水冷卻后各管加指示劑1滴,搖勻;各試管準確加入甲液1.0 mL,混勻,此時溶液變為紅色。吸取調乙液向各管內逐滴小心加入混勻,直至液體中指示劑的顏色變成黃綠色。然后加蒸餾水至10mL,混勻。取4 mL稀釋的水解液,3 500 r/min,離心10 min,取上清1 mL作測定用。按測定操作采用ELISA試劑盒法進行檢測。在空白管、標準管、測定管中分別加入相應試劑,放入60℃水浴15 min,冷卻后,3 500 r/min離心10 min,取上清,用752紫外光柵分光光度計(波長為550 nm,1 cm比色皿,用蒸餾水調零)測定各管吸光度(A)值。根據公式計算HYP含量。HYP含量(μ g/mg濕重)=(測定管A值-空白管A值)÷(標準管A值-空白管A值)×標準管含量(5 μ g/mL)×水解液總體積(10 mL)÷組織濕重(mg)。

3 結 果

3.1 小鼠血清中IL-4、IFN-γ、TNF-α含量比較

與空白組比較,模型第14天和第28天組血清IL-4、TNF-α含量顯著增加(P<0.05),IFN-γ量顯著減少(P<0.05);地塞米松組與BLM 組比較,14 d和28 d組血清IL-4、TNF-α含量顯著增加(P<0.01),IFN-γ量顯著減少(P<0.05)。見表1。

表1 地塞米松對小鼠血清中細胞因子的影響( x±s,n=5)

3.2 小鼠肺組織中羥脯氨酸(HYP)含量的影響

BLM組各時間點Hyp含量當14 d和28 d時高于對照組,有明顯增加(P<0.01)。DXM與BLM 組Hyp相比較,Hyp含量于14和28 d有明顯下降(P<0.05)。見表2。

表2 3組小鼠肺組織勻漿中羥脯氨酸含量的變化(μ g/mg, x ±s,n=5)

4 討 論

肺纖維化是多種肺部疾病的共同引起的。誘發肺纖維化的病因眾多,發病機制復雜,感染、粉塵吸入、使用某些藥物均可導致肺纖維化。雖然不同的病因所導致的纖維化各有特點,但主要特征性病變均為肺成纖維細胞大量增生及細胞因子。由于細胞因子失衡可能主要參與了早期肺泡炎的發生、發展有關[3-4]。

肺纖維化的實驗動物模型有多種建立方法,包括抗肺組織抗體、博萊霉素、放射線、百草枯病毒、高濃度氧等均可誘發,而且均能較好地反映肺纖維化的發病過程及病理特征。TNF-α是一種具有廣泛生物活性的細胞因子,與肺纖維化和間質性炎癥密切相關,可誘導肺成纖維細胞等靶細胞的增殖與分化[5-6]。IFN-γ具有抗纖維化作用,TNF-α、IL-4具有促進纖維化作用。刺激細胞外基質蛋白的表達,調節細胞的增殖和分化,并在調節炎癥反應和細胞介導的免疫應答方面發揮重要作用[7]。HYP是組成機體膠原蛋白的一種特有的氨基酸,幾乎所有HYP都存在于膠原中,因此組織中HYP為膠原纖維所特有,其含量可作為膠原組織代謝的重要指標,因此膠原的沉積可用HYP的含量來反映,亦可作為藥物療效指標[8]。

本實驗選用地塞米松對肺纖維化小鼠進行干預,實驗結果顯示:模型組:肺纖維化與對照組比較,第14天和第 28天時 TNF-α、IL-4細胞因子有明顯升高,IFN-γ與對照組差異無顯著性(P>0.05)。干預后的 14 d和28 d時TNF-α、IL-4細胞因子也有明顯升高,而IFN-γ有所下降。同時模型組與干預后比較差異有顯著性(P<0.05,P<0.01)。作用第7天后HYP含量差異無顯著性,作用第14天和28 d后HYP含量比較差異有顯著性(P<0.05,P<0.01)。提示故本研究主要選擇在14 d和28 d觀察地塞米松對細胞因子和羥脯氨酸異常變化的影響。使得Th1/Th2細胞因子失衡是肺纖維化的發病機制之一。即在特發性肺纖維化中Th2型細胞因子反應占優勢,Th1型細胞因子相對不足促進了肺纖維化的發生、發展。使用地塞米松能夠調整Th1/Th2細胞因子失衡[9-11]。早期應用地塞米松可使BLM致大鼠肺纖維化模型血清中TNF-α水平下調,推測地塞米松可能對TNF-α有阻斷作用,從而起到干預肺纖維化的作用。因此地塞米松有良好的防治纖維化的作用,地塞米松能減輕肺纖維化大鼠肺組織肺泡炎及肺纖維化程度,調節Th1/Th2細胞因子失衡、TNF-α水平可能是地塞米松防治肺間質纖維化的作用機制之一。

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