硫酸酯化茯苓多糖對裸鼠胃腺癌的抑制研究

李云橋,侯曉華,王藝峰,張俐娜

(華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院,1.老年科;2.消化內科,湖北武漢,430022;3.武漢大學,湖北 武漢,430074)

胃癌是最常見的惡性腫瘤之一,隨著社會人口老齡化,老年胃癌患者的人數正逐年增加,成為胃癌發病的主體人群[1]。由于老年人胃癌多為中晚期,且老年人免疫功能低下,夾雜病癥多,對放化療的耐受的也差,因此合理應用輔助化療與免疫生物治療等綜合療法是提高老年人胃癌中位生存期的重要途徑[2]。研究表明,一些天然多糖具有增強機體免疫活性[3]和顯著抗腫瘤[4-5]作用,目前多糖已廣泛用于食管癌、胃癌、肝癌的輔助治療[6]。茯苓一直是最重要的傳統中藥之一。本組前期研究表明[7],硫酸酯化茯苓多糖(SPCS3-II)有顯著的體外抗胃腺癌作用,且對低分化的胃腺癌細胞株MKN-45的抑制有較好的劑量依賴性。因此為進一步探討其在體內的抑制效果,本實驗選用裸小鼠進行了體內活性實驗。應用裸鼠人胃癌移植瘤模型研究硫酸酯化茯苓多糖對裸鼠人胃癌移植瘤生長的抑制作用,旨在為胃癌的輔助化療和免疫生物治療提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

樣品由武漢大學化學系張俐娜院士課題組提供,包括從新鮮茯苓菌核的0.5 M NaOH提取物(1※3)-β-D-葡聚糖PCS3-II,以及以PCS3-II為原料制備的硫酸酯化S-PCS3-II,樣品制備所用試劑為分析純。SPF級裸小鼠BalB/CA nu品系40只,4周齡,平均體重(18.5±0.7)g,均為雄性(中國醫學科學院動物研究所提供)。

1.2 樣品制備

茯苓菌核多糖提取和純化、硫酸酯化茯苓多糖制備方法見文獻[8-9]。

1.3 方法

1.3.1 細胞復蘇:在液氮罐中取出凍存的低分化程度的胃腺癌細胞株MKN-45,在37℃水浴中融化,離心,2 500 rpm×5 min。去上清,用RPMI1640培養液洗一次,接種于25 mL的培養瓶中,加8ml含10%胎牛血清的RPMI1640培養液。放二氧化碳培養箱中培養(37℃,50 mL/LCO2),次日換培養液1次。

1.3.2 細胞傳代:在顯微鏡下觀察細胞生長情況,如生長正常且基本長滿瓶底時即可傳代,2～3 d傳1次。去培養上清液,用37℃水浴預熱的含0.02%EDTA的PBS(0.01M)消化細胞 7 min,去消化液,加16 mL含10%胎牛血清的RPMI1640培養液,震搖均勻后分裝在兩個培養瓶中,放CO2培養箱中培養(37℃,50 mL/L)。

1.3.3 接種細胞懸液制備:無菌操作體外培養的MKN-45細胞3瓶裝25 cm規格的培養瓶,瓶內貼壁生長的人胃腺癌細胞系MKN45細胞,生長達80%匯合;在每瓶中各加入0.25%胰酶1 mL后,置 37℃孵育5 min左右,進行消化;取出培養瓶,置倒置顯微鏡下觀察,見胞質回縮、細胞間隙增大,此時傾去胰酶溶液,每瓶中加入含新鮮10%小牛血清的RPMI1640培養液中10 mL終止消化;收集此懸液1 000 rpm離心×3 min,傾去上清液;離心,洗滌細胞2次;取生理鹽水6 mL吹散混勻被離心的細胞后,取0.1 mL稀釋10倍;用0.4%臺盼藍染色后,血細胞記數活細胞;當活細胞比率>95%,調整細胞濃度至4×106個細胞/mL時,準備接種。

1.3.4 抗腫瘤活性試驗:①皮下接種:抽吸出0.2 mL的細胞懸液,接種在32只裸鼠右側下肢腹股溝皮下;②分組及給藥:40只SPF級裸小鼠共分5組,包括正常飲水飲食1組(8只),瘤體接種后1周將荷瘤鼠隨機分為4組:生理鹽水(陰性對照)組、低劑量治療組、高劑量治療組、5-氟尿嘧啶(5-Fu)(陽性對照)化療組,每組8只。皮下接種24 h后給藥,治療組給以茯苓多糖腹腔注射,低劑量治療組25 mg/(kg·d),高劑量治療組250 mg/(kg·d),化療組第1、3、5天腹腔注射 5-Fu,50 mg/(kg·d);每組每次腹腔注射量為0.2 mL,連續給藥3周。

1.4 觀察指標

①觀察成瘤情況并記錄。②病理形態觀察:解剖荷瘤鼠,大體觀察移植瘤生長狀況與周圍臟器受累及情況;腹腔內淋巴結轉移情況;主要臟器(肝、肺、腎)有無轉移灶;腹水的量與性狀。另取部分瘤組織/淋巴結及主要臟器于光學顯微鏡下觀察。部分瘤組織在電鏡下觀察。③計算腫瘤抑制率(ξ)和體重變化率(f)。ξ=[(Wc-Wt)/Wc]×100%;f=[(Wa-Wb)/Wb]×100%。處死裸小鼠后,從皮下完整剝離取出腫瘤組織,剔出纖維薄膜,于電子天平上稱取瘤重W,式中Wt為注射樣品組和陽性對照組裸小鼠組腫瘤的平均重量,Wc為陰性對照組腫瘤的平均重量,Wb和Wa分別為給藥前后的裸小鼠組平均體重。將試驗組瘤塊的重量與對照組比較,觀察以上試樣對腫瘤生長的抑制作用。

2 結 果

2.1 腫瘤組織病理學觀察

移植瘤生長狀況:皮下移植后1周左右可于皮下觸及包塊,隨后腫瘤結節逐漸生長增加,4周時陰性對照組腫塊可達到1.3 cm×0.4 cm左右,大部分動物消瘦明顯,活動欠佳。裸鼠皮下移植瘤成功率為100%,瘤塊多呈圓形、實質形,表面有結節狀隆起,呈淡紅色魚肉狀,且瘤塊與周圍組織粘連不明顯,包膜完整,與基底和周圍組織粘連不明顯。

2.2 病理切片光鏡下顯示

瘤體組織均為胃腺癌細胞,核大小不一,染色深,細胞間質少。瘤細胞排列呈索狀或巢狀,無明顯腺體結構存在,陰性對照組瘤組織中瘤細胞大,呈橢圓形,胞漿紅染,細胞核大而色深,核漿比例失調,而在化療組與治療組中,瘤細胞相對較小,核漿比例也相對接近正常,胞漿中有空泡,核結構模糊(見圖1)。未見腹水、淋巴結和其他臟器轉移。

圖1 瘤體組織蘇木精-伊紅色(H.E染色)

2.3 腫瘤大小及腫瘤抑制率變化

與空白對照組比較,荷瘤裸小鼠體重增長緩慢,有顯著性差異(P<0.05),能明顯抑制腫瘤的生長,與陰性對照組比較,有顯著性差異(P<0.05),但高低劑量在抑制腫瘤生長和體重增長方面沒有顯著性差異(P>0.05),與5-Fu組抑瘤率(58.3%)相比,硫酸酯化茯苓多糖抑瘤率低于5-Fu組,但體重增加率遠高于5-Fu組,有顯著性差異(P<0.05)。總之,硫酸酯化茯苓多糖能有效抑制胃腺癌的增長,在改善荷瘤裸鼠的生長狀況,與陰性對照組和5-Fu組比較有顯著性差異(P<0.05),優于5-Fu組。見表1。

表1 硫酸酯化茯苓多糖對裸小鼠皮下胃腺癌移植瘤的抑制作用( x±s)

3 討 論

茯苓長期以來作為傳統中藥在中國和許多亞洲國家被廣泛應用,它具有很高的保健功能和藥用價值。從茯苓中提取的多糖能抑制白血病細胞株HL-60的生長,且和其他多糖聯用可以增強其抗腫瘤活性,茯苓多糖在體內外都能抑制S-180的生長,在體外能抑制白血病細胞株HL-60和肝癌細胞株HepG2的生長,在前期的實驗中,本組取從茯苓菌核中提取分離出的堿溶性多糖PCS3-II的5種衍生物進行了體外抗胃腺癌抑制試驗,得知硫酸酯化茯苓多糖在體外對胃腺癌細胞株MKN-45有較好的抑制率,且呈劑量依賴性[7]。為了進一步研究其在體內的抑癌效果,本研究選用裸小鼠進行了體內抗胃腺癌移植瘤的實驗,也取得了預期實驗結果。Chen X等[10]報道硫酸酯化茯苓多糖通過免疫增強行抗腫瘤作用,說明對茯苓多糖進行硫酸酯化衍生是一種有效的方式,能有效地增強機體免疫作用而發揮對胃腺癌的抑制作用。

裸小鼠胃癌移植瘤模型也相繼建立,具有很好的穩定性和簡單易行的特點,且裸小鼠皮下移植瘤模型穩定、方便易行。本實驗在32只裸小鼠皮下接種胃腺癌MKN-45細胞株,結果顯示腹股溝皮下接種致瘤率100%,主要原因為腹股溝皮下血管豐富,有利于胃癌細胞的生長,裸小鼠移植瘤生長4周后處死,解剖發現瘤體組織均為胃癌細胞,且腫瘤組織周圍有膜包裹,病理切片檢查心、肺、肝、腦、腎、胰均未發現有癌細胞轉移,有文獻報導,皮下接種致瘤不容易發生轉移。本實驗結果與此一致[11-13]。

本實驗結果表明,不同劑量的硫酸酯化茯苓多糖都能有效地抑制胃腺癌的生長,硫酸酯化茯苓多糖不像5-Fu那樣有很強的細胞毒性,在殺死腫瘤細胞同時也殺死正常細胞。高劑量組的抑制率達到47.9%,且能改善機體的生長狀況。硫酸酯化茯苓多糖衍生物值得進一步研究開發,以期為抗胃腺癌輔助化療和免疫生物治療的進一步研究、開發和利用提供重要科學依據。

[1] 蔡昌豪,吳本儼.老年人消化系統多原發癌的診斷和治療[J].中華老年醫學雜志,2009,28(4):270.

[2] 陳 凜,李 濤.胃癌綜合治療現狀與進展[J].世界華人消化雜志,2008,16(6):571.

[3] Joseph MM,Aravind SR,Varghese S,et al.Evaluation of antioxidant,antitumor and immunomodulatory properties of polysaccharide isolated from fruit rind of Punica granatum[J].Mol Med Report,2012,5(2):489.

[4] Melo-Silveira RF,Fidelis GP,Costa MS,et al.In vitro antioxidant,anticoagulant and antimicrobial activity and in inhibition of cancer cell proliferation by xylan extracted from corn cobs[J].Int J Mol Sci,2012,13(1):409.

[5] Wang JL,Bi Z,Zou JW,et al.Combination therapy with lentinan improves outcomes in patients with esophageal carcinoma[J].Mol Med Report,2012,5(3):745.

[6] Ina K,Furuta R,Kataoka T,et al.Lentinan prolonged survival in patients with gastric cancer receiving S-1-based chemotherapy[J].World J Clin Oncol,2011,2(10):339.

[7] Wang Y,Zhang L,Li Y,et al.Correlation of structure to antitumor activities of five derivatives of a beta-glucan from Poria cocos sclerotium[J].Carbohydr Res,2004,339(15):2567.

[8] 張俐娜,王藝峰,侯曉華,等.抗腫瘤活性茯苓菌核葡聚糖硫酸酯及其制備方法和用途[P].中國專利:1583800,2005-02-23.

[9] Wang Y,Zhang M,Ruan D,et al.Chemical components and molecular mass of six polysaccharides isolated from the sclerotium of Poria cocos[J].Carbohydr Res,2004,339(2):327.

[10] Chen X,Zhang L,Cheung PC.Immunopotentiation and anti-tumor activity of carboxymethylated sulfated beta-(1-->3)-d-glucan from Poria cocos[J].Int Immunopharmacol,2010,10(4):398.

[11] 劉 靖.早期胃癌60例臨床分析[J].實用臨床醫藥雜志,2010,14(23):120.

[12] 黃惠風,錢建業,謝少茹.黃芪多糖對人胃癌細胞M KN45誘導凋亡和細胞周期的影響[J].實用臨床醫藥雜志,2010,14(19):17.

[13] 吳宜嘉,蔣兆榮.卡培他濱聯合胸腺五肽治療晚期胃癌的臨床觀察[J].實用臨床醫藥雜志,2010,14(23):55.