蕓薹屬蔬菜花期分子調控研究進展

宋明許俊強湯青林葛文東王志敏

（西南大學園藝園林學院，南方山地園藝學教育部重點實驗室，重慶市蔬菜學重點實驗室，重慶400715）

蕓薹屬蔬菜（例如甘藍類、白菜類和芥菜類等）的開花調控成為近年來分子生物學研究的熱點。目前已經克隆了開花轉變的一些關鍵基因，并確定了它們的部分功能特性（He & Amasino，2005；Michaels，2009）。FLC（FLOWERING LOCUS C）是春化途徑的關鍵基因，在自主途徑中也起著重要作用。FLC基因的分離及其在春化過程中的表達方式為春化分子機理提供了新信息（洪薇和曹家樹，2002）。春化作用可降低FLC的表達水平以促進植株開花；自主途徑的一系列基因對FLC表達起負調控作用。光周期途徑基因雖然對FLC表達水平無顯著影響，卻通過正調控FLC的下游因子SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS 1（SOC1）、FLOWERING LOCUS T（FT）與春化途徑和自主開花途徑相聯系（Blazquezm et al.，1997；雍偉東 等，2000）。通過施加外源赤霉素證明赤霉素（GA）能促進擬南芥開花。環境條件誘導和遺傳分析表明，開花轉變相關基因分布在4條不同的調控途徑中，即春化途徑、光周期途徑、赤霉素途徑和自主途徑。這些途徑涉及到外源或內源信號刺激，最后匯入到“開花信號整合子”，從而進一步激活花分生組織特征基因（圖1）。成花轉變過程中，各種成花誘導信號傳遞到花分生組織特性基因AP1、LFY后，使花形態建成（劉麗娜 等，2003）。Lagercrantz等（1996）利用大量擬南芥基因探針證實了蕓薹屬蔬菜開花相關基因與擬南芥具有同源性。近年來，隨著對模式植物擬南芥開花時間分子機制的突破性研究，蕓薹屬蔬菜花期分子調控也陸續有少量研究報道，但仍然不很深入。因此，借鑒模式植物擬南芥研究成果，深入研究蕓薹屬蔬菜開花機制，對作物育種具有非常重要的意義。

圖1 擬南芥花期調控途徑（Jung & Muller，2009）

1 春化途徑和自主途徑關鍵基因FLC

FLC基因及其同源物不僅存在于模式植物擬南芥中，而且也存在于甘藍類、蕪菁類以及鹽芥等蕓薹屬作物中（Tadege et al.，2001；Lin et al.，2005；Fang et al.，2006；Kim et al.，2007），甚至十字花科植物以外的其他科屬植物中也存在FLC同源基因（Reeves et al.，2007）。在甘藍型油菜（B.napus）和相關蕓薹屬物種中，開花時間相關基因的QTL已定位，已經克隆了多個FLC同源基因，例如甘藍型油菜（B.napus）BnFLC1-5（Tadege et al.，2001）、甘藍（B.oleracea）BoFLC1-5（Schranz et al.，2002；Lin et al.，2005；Okazaki et al.，2007；Razi et al.，2008）、蕪菁（B.rapa）BrFLC1-5（Schranz et al.，2002；Lin et al.，2005；Kim et al.，2007）。

FLC編碼MADS域轉錄因子，抑制花期轉變。FLC的主要促進子是FRI（Johanson，2000），它能維持FLC高水平表達（Sheldon et al.，1999），在春化途徑中抑制植物開花。春化作用會導致FLC的組蛋白修飾，從而抑制FLC表達。最近研究表明，其他MADS域基因，如FLOWERING LOCUS M（FLM）/MADS AFFECTING FLOWERING 1（MAF1）、MAF2、AGAMOUS-LIKE 24（AGL24）和AGL19也受春化調控（Alexandre & Hennig，2008）。FRI及其同源基因通過自主途徑正調控FLC（Simpson，2004；B?urle & Dean，2006），而春化作用會抑制FLC表達（Schmitz &Amasino，2007）。延長低溫春化處理，會使VERNALIZATION INSENSITIVE 3（VIN3）基因表達逐漸上調，維持FLC表達的穩定抑制。在下一代中，FLC表達特性大約在胚胎發生早期重置（Choi，2009），恢復FLC表達，因此下一世代植株開花需要重新春化處理。大白菜抽薹時間與現蕾時間 QTLs分析表明，BrFLC2和BrFLC1分別定位在 DBOQTL1/DBUQTL1/DFLQTL1和DBOQTL3/DBUQTL2/DFLQTL2區域，這兩個位點與前人研究的開花時間QTL相吻合（Kim et al.，2007；Yuan et al.，2009）。

蕓薹屬蔬菜作物FLC與擬南芥AtFLC高度同源性，也在開花抑制中起核心作用。從大白菜開花時間QTL位點分別分離出3個FLC同源基因（BrFLC1、BrFLC2、BrFLC5），它們對環境較為敏感，調控開花時間，這與前人在BrFLC1上的研究結論類似（Schranz et al.，2002；Zhao et al.，2010）。而在甘藍（B.oleracea）中，目前克隆到了與開花時間QTL相關的FLC同源基因BoFLC2（Okazaki et al.，2007；Razi et al.，2008）。擬南芥BnFLC1-5和大白菜BrFLC1-3組成型表達均會顯著延遲開花（Tadege et al.，2001；Kim et al.，2007），由此表明大白菜FLC基因和擬南芥高度保守，作為花期調控子具有相同或相似的功能。

蕓薹屬春化開花能力是通過長時間暴露在低溫下獲得的。甘藍需一定大小植株才能低溫春化，與此不同的是，白菜類在種子階段就可以感受春化。春化處理后FLC的抑制作用包括低溫處理期FLC的初步抑制和回暖后的持續抑制。雖然這兩個過程密切相關，但參與FLC初步抑制或FLC持續抑制的基因并非完全相同。例如，包括VIN3或其同源VERNALIZATION 5（VRN5）/VIN3-LIKE 1（VIL1）的PHD域的突變主要阻礙低溫時FLC的初步抑制作用（Kim et al.，2007）。相比之下，在vrn1和vrn2突變體中，FLC是通過春化初步抑制，但抑制作用在回暖后不會持續（Kim et al.，2007）。然而，FLC在初步抑制和持續抑制間的界限尚不明確。VRN1、VRN2也被證明參與了FLC的初步抑制作用（Colasanti & Coneva，2009）。VIN3和VRN2和其他染色質重塑蛋白，如涉及到H3K27甲基化作用的CURLY LEAF（CLF）、SWINGER（SWN）與FERTILIZATION INDEPENDENT ENDOSPERM（FIE）一起參與多阻遏復合物 2（PRC2）的形成。LIKE HETEROCHROMATIN 1（LHP1）已被證明結合到H3K27甲基化的組蛋白，而lhp1突變體不能保持春化后FLC的持續抑制狀態（Shitsukawa，2007）。LHP1增強春化后FLC位點的抑制，因此可能在識別春化作用和感應H3K27標記中發揮作用，可能經由異染色質化促成FLC的穩定遺傳抑制。VIN3目前被認為是春化途徑中最上游的元件。然而，VIN3的表達只有在低溫處理幾周后才被感應（Sung & Amasino，2004）。通過春化調控VIN3的研究表明，仍有參與春化途徑的其他元件尚未鑒定。

總體來說，油料類和一些小白菜栽培品種在非春化條件下早花。晚花類型的大白菜和蕪菁需要長時間春化處理以加速開花，蕪菁和大白菜雙單倍體種群的開花時間具有多態性標記位點。研究表明大白菜BrFLC1基因突變會引起開花時間變化（Yuan et al.，2009）。大白菜不同FLC同源基因和開花相關的其他基因的功能以及它們之間的相互作用有待進一步研究。Long等（2007）利用甘藍型油菜與擬南芥比較圖譜的結果，將與擬南芥春化途徑中的關鍵基因FLC的同源基因（BnFLC.A10）定位到春油菜開花時間主效QTL置信區間的峰值處。對等位基因功能的分析和對 DNA序列的生物信息學分析表明，冬油菜和春油菜的種性區別，主要決定于FLC基因調控區是否含有一段由較多A/T堿基組成長約600 bp的DNA序列。黃細松（2006）研究發現大白菜通過低溫處理后FLC的表達非常弱，當植株莖端開始向生殖生長轉化時FCA和FT的表達有增強的趨勢，但是FLC和FCA之間沒有明確的關系。原玉香等（2008）利用抽薹開花時間差異大的白菜類蔬菜材料、基于FLC基因序列變異開發了BrFLC1基因的CAPS標記，并發現BrFLC1基因的剪接位點突變與抽薹性顯著相關（Yuan et al.，2009）。Schranz等（2002）認為多拷貝的BrFLCs基因是蕓薹屬作物開花時間表型變異的基礎，BrFLC以加性效應的互作方式調控開花時間。

2 光周期途徑關鍵基因CO

CONSTANS（CO）及CONSTANS-LIKE（COL）是光周期途徑調控開花的關鍵調控子。長日照下CO蛋白在光階段積累并激活不同途徑信號輸入的中心調控子FLOWERING LOCUS T（FT）表達促進開花（Turck et al.，2008），隨后FT蛋白轉移到頂端分生組織處與FD蛋白結合，激活花分生組織基因AP1表達，進而促進植物開花。但在短日照條件下，CO對開花的促進作用不大。而水稻的CO-like基因Hd1在短日照條件下促進開花，在長日照條件下反而抑制開花（Yano et al.，2000）。由此可見，CO及其同源基因在不同植物和不同條件下的作用可能不同。Lagercrantz等（1996）在黑芥（B.nigra）上也發現了擬南芥遲開花基因CO的同源基因。Lagercrantz等（1996）在黑芥中定位了1個QTL，找到候選基因為CO同源基因，該基因是擬南芥光周期調控途徑中的重要基因。蕓薹屬作物的CO同源基因，例如，甘藍型油菜（B.napus）等位基因BnCOa1（Robert et al.，1998）、黑芥雙等位基因BniCoa（Osterberg et al.，2002），與擬南芥CO在功能上高度保守，調控作物開花時間。黑芥CO同源基因BniCOL1發生變異后會影響開花時間（Lagercrantz et al.，1996；Osterberg et al.，2002）。

CO作為開花促進因子，其轉錄受生物節律鐘控制，在清晨表達水平非常低，但天亮后8～10 h內大幅增加（Heggie & Halliday，2005），它在光下穩定而在黑暗中消退（Gould et al.，2006）。長日照下CO的mRNA水平峰值發生在黃昏，但短日照時是在黃昏后，所以長日照使CO積累并促進開花。CO的 mRNA的生物節律鐘調控需要許多蛋白，這些蛋白自身又受生物節律鐘的調控。CYCLING DOF FACTOR1（CDF1）與CO促進子一起，并作為CO轉錄的負調控子。CDF1mRNA在上午高度表達，而此時CO轉錄水平最低。CDF1對CO的抑制作用通過在黃昏表達的GIGANTEA（GI）、FLAVIN-BINDING、KELCH REPEAT和F-BOX PROTEIN1（FKF1）的活性而消除（Putterill et al.，1995；Nelson et al.，2000；Imaizumi et al.，2005；Sawa et al.，2007）。FKF1包含F-box并很可能是SCF泛素連接酶的組分之一。對FKF1和GI的研究表明，CDF1參與其中的相互作用，FKF1-GI復合體涉及到目的CDF1的降低（Sawa et al.，2007）。雖然CDF1的超表達抑制CO的轉錄，但是CDF1的降低不會劇烈增加COmRNA水平。由此表明，CDF1并非CO轉錄的唯一抑制子，很可能還存在其他尚未鑒定的抑制子。當從一個組成啟動子表達時，CO蛋白在白光、藍光或遠紅光下積累，而在紅光或黑暗下消退（Gould et al.，2006）。多種光感受器與CO蛋白調控有關；光敏色素B（PHYB）在早晨促進CO的降解，而PhyA，CRYPTOCHROME1（CRY1）和CRY2基因在黃昏時使CO穩定（Gould et al.，2006）。通過泛素化和20 S蛋白酶蛋白水解導致CO蛋白的降解（Gould et al.，2006），并可能與SUPPRESSOR OF PHYA-105（SPA）家族蛋白有關。SPA1已被證實與E3泛素連接酶CONSTITUTIVE PHOTOMORPHOGENESIS 1（COP1）相互作用，并在spa1、spa3、spa43個突變體中，盡管COmRNA水平不變，但CO蛋白積累水平比野生型高（Hoecker & Quail，2001；Liu et al.，2008）。與這個模型一致，COP1突變體最近也被證實含有高水平的 CO蛋白（Jang et al.，2008）。這些數據表明，SPA-COP1復合體在 CO蛋白降解中起著重要作用。但是，CO蛋白在黑暗條件下降解的機制，長日照和短日照開花調控機制的核心差異，以及長日照和短日照在進化中光周期反應分化的機制等還需要進一步研究。

3 GA調控途徑

GA是重要的開花誘導物質，對FLC的表達水平無顯著影響，但FLC持續過量表達植株的表型與低GA活性的植株表型一致。晚花突變體FLC211（超表達突變體）與野生型和其他晚花突變體相比，對施加外源GA的反應較弱。這說明GA可能在FLC的下游起作用，FLC可能通過調控 GA生物合成或信號傳導而阻斷莖尖的 GA活性，從而減弱對開花的促進作用。

SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CO1（SOC1）和LEAFY（LFY）是赤霉素途徑中關鍵整合子基因，SOC1在葉片和莖端分生組織中表達，花轉變時其表達量迅速上升。在長日照及短日照下供給外源GA能夠提高SOC1的表達（Borner et al.，2000）。ga1-3突變體在短日照內不能開花，體內SOC1表達量處于較低水平，用GA處理后，ga1-3即恢復開花，SOC1的表達也相應提高。GA僅通過抑制DELLA蛋白的作用調控SOC1的表達，并不需要通過GAMYB的作用（Achard et al.，2004）。LFY在長日照下高表達，短日照下的ga1-3突變體僅在用GA處理的情況下LFY才能表達，組成型表達的LFY可促使短日照下未經 GA處理的ga1-3突變體開花（Blázquez et al.，1998）。Blázquez和 Weigel（2000）研究發現，GA 通過作用于LFY啟動子的一個順式作用元件而激活LFY的表達。ag-1和leafy-6突變體植株在短日照下會發生開花逆轉現象，用GA3和GA4處理短日照下培養的ag-1和leafy-6突變體后，開花逆轉即完全受到抑制，spy-2和spy-3也能完全抑制lfy-6的開花逆轉（Eriksson et al.，2006）。王薇等（2008）對大白菜的研究表明：GA3處理還可以不同程度地提高內源GA含量。可見外源GA3能通過GA合成路徑中的去甲基化誘導GA生物合成，提高內源GA水平，促進花分生組織特征基因的表達，使植物從營養生長向生殖生長轉化。King等（2001）對大白菜的研究表明：外源供給GA可以直接促進LFY基因表達，GA信號的靶向LFY啟動子。由于GA的生物合成需要內源IAA處于一定的水平，即IAA有可能通過促進GA的生物合成而間接地影響LFY的表達。夏廣清等（2004）以大白菜為材料，從花蕾中克隆到LFY部分cDNA序列，并對所克隆到的基因進行dsRNA抑制載體的構建，結果發現GA可以促進LFYmRNA的積累和表達，通過導入LFY基因明顯延遲大白菜的抽薹開花。Wurr等（1981）研究也表明在兩年生蕓薹屬基因型中，外源GA3促進莖伸長和開花，且內源GA類的活性是隨著春化而存在的。Rood等（1989）研究表明蕓薹屬植物莖伸長和開花與內源GA類和GA1有關。Kennard等（1994）利用甘藍和青花菜的F2群體的RFLP連鎖圖，鑒定了控制甘藍開花時間和從種植到現蕾天數的主效基因各 2個。開花在突變體蓮座上被抑制，證據表明內源 GA3在蕪菁花發育中起調控作用。Zanewich和 Rood（1995）研究表明：GA缺失的突變體矮小，且未經GA處理植株開花延遲。

4 開花信號的整合

低溫春化是影響植物花期的第一個環境信號，在分生組織中，春化通過開花抑制子FLC的外源抑制促進開花。光周期是影響花期的第二個環境信號，在葉輸導系統中，CO蛋白僅在能夠促進FT表達的長日照下產生，FT蛋白然后移位到促進開花感應的分生組織（Turck et al.，2008；Serrano et al.，2009）。

春化途徑、光周期途、自主途徑及 GA途徑通過開花整合基因調控開花時間。這些基因包括FT、FT同源基因TWIN SISTER OF FT（TSF）以及SOC1/AGAMOUS LIKE 20（AGL20）等，它們是功能強大的開花促進子（Boss et al.，2004），受CO和FLC負調控。在非春化一年生冬性植物或AP突變體中，FLC高豐度表達并抑制FT、SOC1甚至TSF表達，從而延遲開花（Samach et al.，2000；Hepworth et al.，2002）。研究表明，FLC蛋白很可能直接抑制FT和SOC1（Hartmann et al.，2000；Helliwell et al.，2006）。若干個MADS域轉錄因子往往能形成蛋白復合體，調控植物生長發育進程。一個最經典的例子就是：FLC和另一個 MADS域蛋白 SHORT VEGETATIVE PHASE（SVP）相互作用形成復合體（Hartmann et al.，2000；Li et al.，2008），FLC和SVP蛋白都是開花抑制子，svp突變在很大程度上抑制了FLC的晚花表型（Lee et al.，2007；Li et al.，2008）。開花整合子的充分表達不僅要FLC抑制作用消除，而且還需要通過CO長日照的活化。與FLC不同，CO未被證明可與開花整合子直接作用，但CO是血紅素激活蛋白（HAP）類復合體組分之一，可能間接調控開花整合子（Wenkel et al.，2006）。

趙升等（2003）在外源BoCAL基因對花椰菜花球形態發生的調節及遺傳研究中發現：不結球與BoCAL基因的突變有關，而早散球與BoCAL基因的時空表達有關，BoCAL基因可以調控花球發育的時間和發育速度。FCA通過抑制FLCRNA水平來促進開花；LD依靠FLC并且也影響FLC節律鐘來調控開花時間；FVE基因能獨立調控FLC節律鐘；FPA對FLC不敏感，它同光周期途徑中的基因相互作用（Rouse et al.，2002），還被證實參與赤霉素途徑調控花期（Meier et al.，2001）。春化過程的一些基因如VIN3、VRN1和VRN2（Sung & Amasino，2005）以及自主途徑的一些基因如LFY、FCA、FLD、FVE、FPA、LD和FLK（He & Amasino，2005）則抑制FLC表達。此外，環境因素也會對抽薹開花產生影響。

簡而言之：FLC充當SOC1基因的負調控子，而且FRI在自主成花途徑和春化途徑中是通過對FLC的作用來影響SOC1。在FRI和自主成花基因雙突變體中，SOC1被抑制。此外，FLC的組成型表達在FRI缺失和自主成花突變基因的情況下抑制SOC1。光周期成花基因CO的過量表達雖然對FLC無影響，但卻能增加SOC1的表達，所以SOC1并不是完全由FLC調控的（丁焱 等，2009）。GA通過作用于春化途徑和自主途徑關鍵基因FLC下游的開花整合子SOC1調控作物花期，也可直接作用于開花決定基因LFY。4條途徑相互作用共同調控作物開花。

5 展望

隨著擬南芥和水稻基因組測序的完成和全長 cDNA數據的完善，人們發現擬南芥等幾個模式植物的開花控制基因大部分在蕓薹屬蔬菜作物的基因組中都可以找到同源基因。熒光原位雜交技術（fluorescence in situ hybridization，FISH）的出現，使蕓薹屬作物的細胞學研究從經典的普通細胞學水平走向了現代的分子細胞學水平。蕓薹屬作物的比較基因組學（Comparative genomics）也發展起來，用于分析蕓薹屬物種基因組內部的結構變化。隨著對蕓薹屬蔬菜作物研究的不斷深入，將不斷獲得蕓薹屬作物的分子標記信息，確定抽薹期及開花期的數量性狀位點及控制基因，都會為將來育種奠定理論基礎。隨著蕓薹屬作物基因組測序的完成，蕓薹屬作物的設計育種將從理想逐漸走向現實。以白菜類為代表的蕓薹屬主要作物基因組測序，將為這些作物的遺傳改良提供無限空間。目前在蕓薹屬中已克隆到的絕大多數調控成花的基因都編碼了轉錄因子，主要集中在春化途徑和光周期途徑，而在自主途徑和赤霉素途徑的研究較少，在春化作用中未解決的核心問題是低溫如何被感知和怎樣衡量低溫處理時間的長短。同時在時空上它們是怎樣調控與成花直接相關的基因表達，從誘導到最終花成熟及花多態性的各階段基因是如何進行系統調控的，成花過程中各調控基因之間相互作用的途徑和方式等，這些在將來的研究中都將是重點問題。

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