CYP4 F2、CYP2 C9和VKORC1基因多態(tài)性對中國漢族非瓣膜性房顫患者使用華法林劑量的影響Δ

朱君榮，魏萌，朱余兵，謝渡江，于鋒，葉飛，陶宜富#(.南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京醫(yī)院，南京0006；.中國藥科大學(xué)臨床藥學(xué)教研室，南京0009)

非瓣膜性房顫已取代風(fēng)濕性心臟病引發(fā)的瓣膜性房顫成為我國老年人房顫發(fā)病的最主要原因，且其發(fā)生率隨著年齡的增加呈上升趨勢[1，2]，75歲以上老年人約占非瓣膜性房顫患者的一半[3]。已證實[4，5]，房顫是腦卒中的獨立危險因素，口服抗凝藥華法林可有效減少卒中的發(fā)生。華法林能抑制環(huán)氧化還原酶的作用而抑制維生素K在肝臟細胞內(nèi)合成凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ，從而發(fā)揮其抗凝作用，因療效確切奠定了其在非瓣膜性房顫患者抗血栓治療方案中的基石地位[6，7]，但是該藥抗凝劑量個體化差異大[8]。已證實[9，10]，華法林的代謝酶細胞色素P450(CYP)2 C9和藥效靶點酶VKORC1的編碼基因存在多態(tài)性，這種基因多態(tài)性及年齡、體重、藥物相互作用等臨床特征可解釋約50%的華法林劑量個體差異，其他華法林劑量個體差異的相關(guān)因素仍需進一步探究[8]，這對于規(guī)范華法林抗凝治療有著重要的現(xiàn)實意義。McDonald等[11]發(fā)現(xiàn)，肝臟CYP酶4 F2編碼基因的多態(tài)性會對維生素K的代謝水平產(chǎn)生影響，進而可能導(dǎo)致高加索人群華法林劑量的個體差異[12-14]，而CYP4 F2的基因多態(tài)性對中國漢族非瓣膜性房顫患者劑量影響的研究尚不多見。本研究旨在結(jié)合CYP4 F2以及CYP2 C9、VKORC1的基因多態(tài)性和其他臨床特征，為中國漢族非瓣膜性房顫患者臨床合理使用華法林提供參考。

1 資料與方法

1.1 研究對象

采用回顧性研究方法，收集2009－2011年南京及周邊地區(qū)非瓣膜性房顫患者260例，均為中國漢族人種。入選標(biāo)準(zhǔn):確診為非瓣膜性房顫并服用華法林的患者；穩(wěn)定服用華法林3個月以上(目標(biāo)國際化標(biāo)準(zhǔn)比值(INR)為1.5～3.0[15，16])。排除:明確的出血性疾病，如活動性潰瘍、支氣管擴張等；肝功能不全患者(丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)或者天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)＞3倍上限或者膽紅素＞2倍上限)；腎功能不全患者(血清肌酐≥200 μmol·L－1)；需長期服用抗血小板藥物或非甾體抗炎藥者。

1.2 臨床資料的收集

從所有納入研究的患者病例資料中摘錄性別、年齡、身高、體重、聯(lián)合用藥等基線信息以及華法林劑量和基因測定結(jié)果，并對其進行常規(guī)隨訪。每位患者至少被記錄3次以上在目標(biāo)范圍內(nèi)的華法林用藥劑量。華法林平均穩(wěn)定劑量為患者所測INR值在1.5～3.0之間所記錄的華法林總服用量的日平均劑量。體重指數(shù)(BMI)＝體重(kg)/身高(m)2；體表面積(BSA)＝0.0061×100×身高(m)+0.0128×體重(kg)－0.1529。

1.3 基因分型

1.3.1 基因組DNA的提取和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴增患者簽署知情者同意書后，收集EDTA抗凝的外周靜脈全血2 mL。采用AxyPrep-96 Blood基因組提取試劑盒(Axygen Biosciences，美國)提取DNA，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。CYP2 C9*3、VKORC11173和CYP4 F2基因的引物由上海翼和應(yīng)用生物技術(shù)有限公司設(shè)計和合成(見表1)。PCR反應(yīng)體系體積為20μL，基因組DNA 50ng，上、下游引物各0.4μL，dNTP 2 mmol·L－1，1×PCR緩沖液2 μL，3 mmol·L－1MgCl20.6 μL，Taq聚合酶(1 U·L－1)0.3 μL，1×Q-solution 4 μL。PCR反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性2 min，94℃30 s，62℃90 s，72℃1 min，共35個循環(huán)，72℃延伸7 min。

表1 SNPs位點的上、下游引物Tab 1 Forward and reverse primers of SNPs

1.3.2 基因多態(tài)性檢測用連接酶檢測反應(yīng)(LDR)檢測CYP2 C9*3、VKORC11173和CYP4 F2的單核苷酸多態(tài)性(SNPs)。LDR反應(yīng)體系體積為10 μL，PCR產(chǎn)物1 μL，各位點探針1 μL，1×LDR緩沖液1 μL，Taq聚合酶(2 U·L－1)0.05 μL。LDR反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性1 min，94℃15 s，50℃45 s，共35個循環(huán)。在ABI PRISM 3730 DNA測序儀(Applied Biosystems，美國)上完成測序。用Gene Mapper軟件(Applied Biosystems，美國)完成數(shù)據(jù)分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行統(tǒng)計、分析，計量資料以±s表示，計數(shù)資料以頻數(shù)表示；研究對象Hardy-Weinberg遺傳平衡的符合程度采用χ2檢驗；不同基因型組間華法林口服劑量進行獨立樣本t檢驗或單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。非參數(shù)Spearman等級相關(guān)用于分析華法林劑量需求與年齡、體重、身高、聯(lián)合用藥以及基因多態(tài)性的關(guān)系。采用多元線性回歸法(Stepwise篩選法)得到各變量對華法林劑量需求的貢獻率以及總影響度。

2 結(jié)果

2.1 患者基線信息

患者房顫卒中風(fēng)險評估(CHADS2)得分范圍為2～6分，平均CHADS2得分為(4.2±1.4)分，其他基線信息詳見表2。

表2 患者的基線信息(n，%)Tab 2 Baseline characterastics of the patients(n，%)

2.2 基因分型結(jié)果

2.2.1 Genemapper數(shù)據(jù)分析利用Genemapper軟件進行數(shù)據(jù)分析，SNPs位點Genemapper分型圖見圖1。

2.2.2 基因檢測結(jié)果CYP4 F2 rs2108622、CYP2 C9 rs1057910和VKORC1 rs9934438基因型檢測結(jié)果見表3。所有基因分布符合Hardy-Weinberg平衡。基因型頻數(shù)(%)＝(攜帶某基因型的人數(shù)/總?cè)藬?shù))×100%；等位基因頻數(shù)(%)＝[(攜帶某等位基因雜合子的人數(shù)+攜帶某等位基因純合子人數(shù)×2)/(總?cè)藬?shù)×2)]×100%。

2.3 CYP2 C9*3、VKORC1和CYP4F2基因型與華法林劑量間的關(guān)系

CYP2 C9*1/*3攜帶者所需的華法林日穩(wěn)定劑量為(1.93±1.14)mg，顯著低于CYP2 C9*1/*1攜帶者[(2.72±0.89)mg，P＝0.001]。VKORC11173 TT型攜帶者所需的華法林日劑量低于CT型攜帶者[(3.12±1.20)mg·d－1vs.(2.36±0.87)mg·d－1，P＝0.047]。CYP4 F2TT基因攜帶者所需的華法林日劑量為(3.04±0.98)mg，顯著高于CT型患者[(2.66±1.02)mg，P＝0.037]和CC型患者[(2.60±0.84)mg，P＝0.034]。

多元線性回歸的結(jié)果顯示:年齡、體重、血栓史、合并應(yīng)用β受體阻滯藥或胺碘酮、CYP2 C9*3、VKORC11173以及CYP4 F2各項共解釋了非瓣膜性房顫患者51.7%的華法林劑量差異。多元線性回歸分析扼要結(jié)果見表4。其中，CYP4 F2、血栓史以及合并應(yīng)用β受體阻滯藥分別解釋了4.8%、2.1%和2.6%的華法林劑量差異。回歸方程為Dose＝3.47－0.022(年齡)+0.017(體重)+0.189(血栓史)－0.283(β受體阻滯藥)－0.471(胺碘酮)－0.586(CYP2 C9*1/*3)－0.296(VKORC1 CT)+0.219(CYP4 F2TT)。其中，年齡以“歲”表示；體重以“kg”表示；有過血栓史、合并使用胺碘酮或β受體阻滯藥，出現(xiàn)以上情況則編碼為1，否則編碼為0；對于CYP2 C9*1/*3、VKORC11173 CT、CYP4 F2 TT基因型，出現(xiàn)以上基因型則編碼為1，否則編碼為0。

表3 SNPs位點的基因型與等位基因頻率Tab 3 Allelic frequency and genotype of SNPs site

表4 多元線性回歸分析扼要結(jié)果Tab 4Brief results of stepwise regression analysis

3 討論

華法林是香豆素類口服抗凝藥，通過抑制肝臟維生素K環(huán)氧化還原酶，導(dǎo)致無活性的氧化型維生素K無法還原為有活性的還原型維生素K，阻止維生素K的循環(huán)應(yīng)用，干擾維生素K依賴性凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ的活化，從而達到抗凝的目的[17]。研究[11]表明，CYP4 F2的編碼基因——CYP4 F2 rs2108622的基因多態(tài)性會引起還原型維生素K氧化酶活性的個體間差異，進而影響華法林的劑量需求。McDonald等[11]在高加索人群中的研究顯示，CYP4 F2野生型(CYP4 F2 CC)攜帶者還原型維生素K的氧化酶活性最高，CT攜帶者次之，而TT攜帶者還原型維生素K的氧化酶活性只有CC攜帶者的1/4；CYP4 F2 rs2108622 T攜帶者體內(nèi)有活性的還原型維生素K水平也高于CYP4 F2CC患者，需要的華法林劑量也相應(yīng)增加。研究[12，13]已證實，CYP4 F2 rs2108622基因多態(tài)性對高加索人種華法林的劑量需求的影響為1.5%～2%，對中國漢族心臟瓣膜置換術(shù)后患者的華法林劑量需求影響為3.2%～4%[18，19]。但與心臟瓣膜置換術(shù)后患者只需單用華法林抗凝不同，非瓣膜性房顫患者常合并高血壓、冠心病等多種疾病，聯(lián)合用藥也相應(yīng)增加，這些疾病和藥物都可能會對華法林的抗凝效果產(chǎn)生一定影響。

中、西方人種CYP2 C9*3和VKORC11173突變頻率的巨大差異可以部分解釋中、西方患者華法林劑量之間的差異[9，10]。但是本研究結(jié)果顯示，中國漢族非瓣膜房顫患者CYP4 F2 rs2108622 T的突變頻率為27.3%，與中國健康人群中T的突變頻率(25%)接近，與高加索人群中的突變頻率(28%)差別也不大[20]，由此看出CYP4 F2 rs2108622的突變可能不是導(dǎo)致中、西方患者華法林劑量差異的主要因素。

本研究發(fā)現(xiàn)，CYP4 F2 rs2108622 T攜帶者所需的華法林劑量比C攜帶者高0.4mg·d－1，該位點的基因多態(tài)性可以解釋4.8%的華法林劑量差異；而在高加索人群中的研究顯示，T攜帶者所需的華法林劑量比C攜帶者高≥1 mg·d－1[14]，但該位點的基因多態(tài)性只解釋了1.5%～2%的華法林劑量差異[11，13]，這種現(xiàn)象提示CYP4 F2 rs2108622的基因多態(tài)性可能對中國漢族非瓣膜性房顫患者的華法林劑量的影響大于高加索人群。這可能是因為中國漢族患者對華法林的抗凝作用較為敏感，達到相同的抗凝效果所需要的華法林劑量也低于高加索人種，所以在中國漢族人群中很小的華法林劑量改變卻能在較大程度上解釋華法林的劑量差異，其具體機制仍需進一步研究。

另外，通過多元線性回歸發(fā)現(xiàn)，有血栓栓塞史的患者所需的華法林劑量要略高于無栓塞史的患者(2.76 mg·d－1vs 2.43 mg·d－1，P＝0.047)，這與Gage等[21]的研究結(jié)果相似。同時發(fā)現(xiàn)，β受體阻滯藥(如普萘洛爾)也在一定程度上解釋了華法林的劑量差異，Holbrook等[22]也報道了這一現(xiàn)象。但是，β受體阻滯藥影響華法林抗凝效果的機制仍需進一步探明。另外，胺碘酮也是影響華法林劑量的重要因素，其影響機制可能是胺碘酮及其代謝產(chǎn)物不僅可以改變?nèi)A法林肝內(nèi)代謝的立體選擇性，通過抑制CYP2 C9和CYP1 A2活性，影響S-華法林的代謝失活使其血藥濃度升高；同時，還可以降低S-和R-華法林的清除率，從代謝和清除兩個方面增強華法林的抗凝作用[23，24]。

綜上所述，本研究證實CYP4 F2 rs2108622基因多態(tài)性可以顯著影響中國漢族非瓣膜性房顫患者的華法林劑量。同時，本研究結(jié)合年齡、體重、合并疾病、聯(lián)合用藥以及CYP2 C9、VKORC1和CYP4 F2的基因多態(tài)性建立了中國漢族非瓣膜性房顫患者的華法林抗凝治療的劑量預(yù)測模型，發(fā)現(xiàn)華法林穩(wěn)定劑量與年齡、合并用胺碘酮或者β受體阻滯藥、CYP2 C9*3及VKORC11173位點的基因突變呈負(fù)相關(guān)，而與體重、合并血栓史及CYP4 F2位點的基因突變呈正相關(guān)，希望新模型能為進一步優(yōu)化非瓣膜性房顫患者的華法林個體給藥方案提供一定的理論依據(jù)。

[1]中華醫(yī)學(xué)會心血管病分會.中國部分地區(qū)心房顫動住院病例回顧性調(diào)查[J].中華心血管病雜志，2003，31(12):913.

[2]周自強，胡大一，陳捷，等.中國心房顫動現(xiàn)狀的流行病學(xué)研究[J].中華內(nèi)科雜志，2004，43(7):491.

[3]Furnberg CD，Psaty BM，Manolio TA，et al.Prevalence of atrial fibrillation in elderly subjects(The Cardiovascular Health Study)[J].Am J Cardiol，1994，74(3):236.

[4]Hirsh J，F(xiàn)uster V.Guide to anticoagulant therapy.Part 2:Oral anticoagulants[J].Circulation，1994，89(3):1469.

[5]Hart RG，Benavent O，MeBride R，et al.Antithrombotic therapy to prevent stroke in patients with atrial fibrillation:a meta-analysis[J].Ann Intern Med，1999，131(7):492.

[6]Wann LS，January CT，Lowe JE，et al.2011 ACCF/AHA/HRS focused update on the management of patients with atrial fibrillation(updating the 2006 guideline):a report of the American College of Cardiology Foundation/American Heart Association Task Force on Practice Guidelines[J].Circulation，2011，123(1):104.

[7]Camm AJ，Kirchhof P，Lip GY，et al.Guidelines for the management of atrial fibrillation:the task force for the management of atrial fibrillation of the European Society of Cardiology(ESC)[J].Eur Heart，2010，31(19):2369.

[8]Daniel E，Howard L.Genetic and clinical factors relating to warfarin dosing[J].Trends Pharmacol Sci，2009，30(7):375.

[9]Rieder MJ，ReinerAP，Gage BF，et al.Effect of VKORC1 haplotypes on transcriptional regulation and warfarin dose[J].N Engl J Med，2005，352(22):2285.

[10]Bodin L，Verstuyft C，Tregouet DA，et al.Cytochrome P4502 C9(CYP2 C9)and vitamin K epoxide reductase(VKORC1)genotypes as determinants of acenocoumarol sensitivity[J].Blood，2005，106(1):135.

[11]McDonald MG，Rieder MJ，Nakano M，et al.CYP4 F2 is a vitamin K1oxidase:an explanation for altered warfarin dose in carriers of the V433 m variant[J].Mol Pharmacol，2009，75(6):1337.

[12]Caldwell MD，Awad T，Johnson JA，et al.CYP4 F2genetic variant alters required warfarin dose[J].Blood，2008，111(8):4106.

[13]Takeuchi F，McGinnis R，Bourgeois S，et al.A genomewide association study confirms VKORC1，CYP2 C9，and CYP4 F2as principal genetic determinants of warfarin dose[J].PLoS Genet，2009，5(3):e1000433.

[14]Borgiani P，Ciccacci C，F(xiàn)orte V，et al.CYP4 F2genetic variant(rs2108622)significantly contributes to warfarin dosing variability in the Italian population[J].Pharmacogenomics2009，10(2):261.

[15]孫藝紅，胡大一.華法林對中國人心房顫動患者抗栓的安全性和有效性研究[J].中華內(nèi)科雜志，2004，43(4):258.

[16]Ridker PM，Goldhaber SZ，DaIIielson E，et al.Longterm，lowintensity warfarin therapy for the prevention of recurrent venous thromboembolism[J].N Engl J Med，2003，348(15):1425.

[17]高菲，宋洪濤，曾志勇，等.CYP2 C9和VKORC1基因多態(tài)性對心臟瓣膜置換術(shù)后華法林維持劑量和抗凝效果的影響[J].中國藥房，2010，21(22):2053.

[18]張海燕，薛領(lǐng)，戚傳平，等.基因與臨床因素對華法林劑量的影響研究[J].中國藥房，2010，21(22):2049.

[19]Cen HJ，Zeng WT，Leng XY，et al.CYP4 F2 rs2108622:a minor significant genetic factor of warfarin dose in Han Chinese patients with mechanical heart valve replacement[J].Br J Clin Pharmacol，2010，70(2):234.

[20]The International HapMap Consortium.The International HapMap Project[J].Nature，2003，426(6968):789.

[21]Gage BF，Eby C，Johnson JA，et al.Use of pharmacogenetic and clinical factors to predict the therapeutic dose of warfarin[J].Clin Pharmacol Ther，2008，84(3):326.

[22]Holbrook AM，Pereira JA，Labiris R，et al.Systematic overview of warfarin and its drug and food interactions[J].Arch Intern Med，2005，165(10):1095.

[23]楊揚，姚均迪，林曉耘.胺碘酮與華法林的相互作用[J].海軍醫(yī)學(xué)雜志，2006，27(3):269.

[24]Habib G，Nashashibi M，Khateeb A，et al.Excessive prolongation of prothrombin time among patients treated with warfarin and admitted to the emergency room[J].Eur J Intern Med，2009，19(2):129.