吡哌酸有關物質檢查方法的研究*

顧 云，曹曉云

(天津市藥品檢驗所，天津 300070)

吡哌酸為廣譜合成藥物，可切斷DNA鏈，主要作用于細菌細胞的DNA旋轉酶(gyrase)，干擾DNA的合成而使細菌死亡，對包括綠膿桿菌在內的所有革蘭陰性桿菌均有效，并對部分革蘭陽性菌如金黃色葡萄球菌也有效。吡哌酸與抗生素之間沒有交叉耐藥性;而且與慶大霉素、羧芐青霉素有協同作用。為更好地控制質量，本試驗采用HPLC法測定吡哌酸有關物質，該方法專屬性強、靈敏度高、準確度和重復性好，方法簡便，可作為吡哌酸的有關物質的檢測方法。

1 儀器與試藥

LC-2010 cLass-vp型高效液相色譜儀(日本島津公司)，AG245型電子天平，PB-10型精密 pH計(塞多利斯公司)，恒溫干燥箱DN64(日本Uamato)，紫外線殺菌車DZS3型(上海科凌醫療器械有限公司)。吡哌酸供試品(山東新華制藥股份有限公司提供，批號081195、081196、081197)，吡哌酸對照品(山東新華制藥股份有限公司提供，批號20080512)。乙腈、甲醇為色譜純，水為凈化水，枸櫞酸、癸烷磺酸鈉及其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件及系統適用性 色譜柱：XDS-C18(150 mm ×4.6 mm，5 μm);流動相：枸櫞酸癸烷磺酸鈉溶液(取枸櫞酸5.7 g、癸烷磺酸鈉1.7 g，加水溶解并稀釋至1 000 ml)-乙腈 -甲醇(60∶20∶20);流速：1 ml/min，檢測波長：275 nm，柱溫：30 ℃，進樣量：20 μl，監測器：紫外檢測器(UV)。

2.2 溶液制備

2.2.1 供試品溶液 取本品適量，用流動相溶解并定量稀釋制成每1 ml中約含0.3 mg的溶液，作為供試品溶液。

2.2.2 對照溶液 精密量取供試品溶液適量，加流動相定量稀釋制成每1 ml中含0.6 μg的溶液，作為對照溶液。

2.3 系統適用性試驗 取吡哌酸適量，加流動相制成0.3 mg/ml的溶液，在紫外燈下(254 nm)光照2 h，混勻，作為系統適用性測試溶液。吡哌酸主峰的保留時間約為18 min，雜質A和雜質B分別以相對保留時間約為0.8和1.2限定，兩降解雜質含量分別約為0.3%和0.3%，與主峰的分離度分別不小于 5.0和 3.6，見圖1。

圖1 吡哌酸有關物質測定系統適用性試驗的HPLC色譜圖(XDB柱)

2.4 專屬性試驗 經以下條件破壞，試驗結果表明，雜質峰之間、雜質與主峰之間均能分離良好，本方法專屬性好，色譜圖見圖2。

圖2 酸破壞產物(A)堿破壞產物(B)氧化破壞產物(C)熱破壞產物(D)光照破壞產物(E)溶液紫外光照破壞產物(F)HPLC色譜圖

2.4.1 酸破壞試驗 取吡哌酸(批號081195)15 mg，置50 ml量瓶中，加濃鹽酸1 ml，置100℃水浴中加熱

30 min后，加堿中和，用流動相稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液依法檢查。

2.4.2 堿破壞試驗 取吡哌酸(批號081195)15 mg，置50 ml量瓶中，加1 mol/L NaOH 溶液10 ml，置100℃水浴中加熱1 h后，加酸中和，用流動相稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液依法檢查。

2.4.3 氧化破壞試驗 取吡哌酸(批號081195)15 mg，置 50 ml量瓶中，加 H2O2(30%)溶液 1 ml，室溫放置30 min后，用流動相稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液依法檢查。

2.4.4 熱破壞試驗 取吡哌酸(批號081195)15 mg，置50 ml量瓶中，置105℃干燥箱內加熱2 h后，用流動相稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液依法檢查。

2.4.5 光照破壞試驗 取吡哌酸(批號081195)15 mg，置50 ml量瓶中，于強光下(4 000±500)Lx照射24 h后，用流動相稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液依法檢查。

2.4.6 溶液紫外光照破壞試驗 取吡哌酸(批號081195)15 mg，置50 ml量瓶中，用流動相稀釋至刻度，于254 nm紫外光下照射2 h后，搖勻，濾過，取續濾液依法檢查。

2.5 最小檢出限 取吡哌酸適量，精密稱定，用流動相溶解并制成每1 ml含0.6 μg的溶液(相當于供試品溶液的0.2%)，依次倍量稀釋，依法測定，結果對照溶液濃度為0.013 μg/ml時，峰高為基線噪音的3～4倍，故最低檢出濃度為0.013 μg/ml(相當于供試品溶液的0.04%)。

2.6 供試品溶液穩定性 供試品溶液(批號081195)，分別在1、2、4、6、18 和 24 h 時進樣，測定峰面積，結果峰面積的RSD為0.15%(n=6)，表明供試品溶液在24 h內比較穩定。

2.7 線性范圍 取“2.2.2”項下的對照溶液，分別精密量取0.5、1.0、5.0、10.0、20.0 和 30.0 ml，各置于100 ml量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻。依法測定，以峰面積與其濃度(μg/ml)進行線性回歸，回歸方程為：Y=198 466 X+540.43(r=1.000 0)。由此可見，吡哌酸濃度在 0.062 7 ～3.760 8 μg/ml范圍內線性關系良好。

2.8 有關物質的檢查 取“2.2.1”和“2.2.2”項下的供試品溶液和對照溶液，精密量取對照溶液10 μl注入液相色譜儀，調節檢測靈敏度，使主成分色譜峰的峰高約為滿量程的10%，再精密量取供試品溶液10 μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主成分峰保留時間的2倍。供試品溶液色譜圖見圖3。若顯示雜質峰，單個雜質峰面積不得大于對照溶液主峰面積的0.2倍(0.2%)，各雜質峰面積的和不得大于對照溶液主峰面積(1.0%)。三批樣品最大單一雜質均為0.1%，雜質總量均為0.2%。結果均符合規定。

圖3 吡哌有關物質的供試品HPLC色譜圖

3 討論

3.1 相關性 本方法進行了相關性考查試驗，供試品溶液的濃度在0.1～0.5 m/ml范圍內，溶液的濃度與有關物質含量有良好的相關性。

3.2 粗放度 本方法采用不同型號色譜柱［XDBC18(150 mm × 4.6 mm，5 μm)、TSK ODS-80 S(150 mm ×4.6 mm，5 μm)、TC-C18(150 mm × 4.6 mm，5 μm)］測定同批樣品(批號081195)有關物質，測定結果基本一致，本方法耐用性良好，可以作為控制吡哌酸質量的有效手段。

3.3 適用性試驗 EP 6.0/BP2008以對羥基苯甲酸乙酯與吡哌酸混合溶液進行系統適用性試驗，要求兩者分離度應不低于4.0，測試結果，兩者保留時間分別為11.1 和16.9 min，兩峰相距較遠，分離度為10.8，且供試品在對羥基苯甲酸乙酯出峰處無雜質。曾試驗以對羥基苯甲酸乙酯和多種沙星類同系物作為分離度對照物峰，效果均不理想。本方法的系統適用性試驗，是經不同條件的破壞實驗，從中篩選出以紫外燈下(254 nm)光照2 h的供試品溶液作為分離度測試溶液。吡哌酸主峰的保留時間約18 min，雜質A和雜質B分別以相對保留時間約為0.8和1.2限定，兩降解雜質含量分別約為0.3%和0.3%，與主峰的分離度分別不小于 4.5 和3.5。

本方法采用高效液相色譜法取代以往薄層色譜法來測定有關物質，其結果可靠，經方法學驗證，此方法專屬性強、靈敏度高、準確度和重復性好，可作為吡哌酸的有關物質的檢測方法。