一株拮抗紋枯病菌放線菌的篩選及鑒定

崔宇輝，王媛媛，汪鵬榮，高愛同，曹麗凌，蔣冬花

(浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江金華 321004)

水稻紋枯病俗稱“花腳病”，為水稻三大病害之一，尤以密植矮稈雜交稻的高產(chǎn)田發(fā)病最為普遍和嚴(yán)重，往往導(dǎo)致水稻葉片枯死、結(jié)實(shí)率降低、千粒質(zhì)量減輕，一般發(fā)病田塊能導(dǎo)致減產(chǎn)15% ～20%，嚴(yán)重時(shí)可達(dá)60% ～70%，甚至絕收［1-2］.該病在早、中、晚稻上均有發(fā)生，危害性極大，在世界各稻作區(qū)普遍發(fā)生，且近年來有逐年加重的趨勢(shì)［3］.

水稻紋枯病是由立枯絲核菌侵染引起的一種真菌病害，又稱云紋病，其典型癥狀是云紋狀病斑和菌核［4］.2010年，于艷敏等［5］篩選到一株芽孢桿菌屬的生防菌R13對(duì)水稻紋枯病病原菌具有一定的抑制作用，抑菌率為67.8%，可以導(dǎo)致正常的紋枯病菌絲體發(fā)生扭曲、變形、原生質(zhì)外溢，并且明顯延遲了菌核的形成時(shí)間.2011年，農(nóng)倩等［6］從水稻體內(nèi)分離得到的細(xì)菌菌株B196對(duì)水稻紋枯病菌的生長有較強(qiáng)的抑制作用.在缺乏水稻抗紋枯病品種的情況下，生產(chǎn)中用的藥劑有:井岡霉素、滅銹胺、苯甲丙環(huán)唑乳油等［7-8］.其中，最常用的井岡霉素自1973年由上海農(nóng)藥研究所開發(fā)應(yīng)用以來，一直是抗紋枯病的當(dāng)家藥品，但因長期連續(xù)使用，造成病菌抗藥性增強(qiáng)，從而使防治效果不理想［9］.所以，有必要探索利用拮抗微生物進(jìn)行生物防治的新途徑，篩選出更多的有應(yīng)用價(jià)值的拮抗紋枯病的新菌種.

本研究對(duì)采自金華市各地的68份土壤中的放線菌株進(jìn)行分離篩選，獲得一株對(duì)紋枯病菌具有較強(qiáng)拮抗作用的放線菌Sh-43菌株，通過形態(tài)特征、培養(yǎng)特征、生理生化特征和16S rDNA序列及系統(tǒng)發(fā)育分析等方面的研究，鑒定Sh-43菌株為吸水鏈霉菌(Streptomyces hygroscopicus).

1 材料與方法

1.1 供試菌株

水稻紋枯病菌(Rhizoctonia solani)由浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供;苦瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum)、小麥赤霉病菌(Fusarium graminearum)和番茄葉霉病菌(Cladosporium fulvum)由浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室保存.

1.2 培養(yǎng)基

放線菌的分離和保存采用高氏一號(hào)培養(yǎng)基;拮抗放線菌株的篩選及苦瓜枯萎病菌、小麥赤霉病菌和番茄葉霉病菌的培養(yǎng)均采用PDA培養(yǎng)基.

高氏一號(hào)培養(yǎng)基:可溶性淀粉 20 g，KNO31 g，NaCl 0.5 g，K2HPO40.5 g，MgSO40.5 g，F(xiàn)eSO40.5 g，瓊脂 20 g，水 1 000 mL，pH 7.2 ～7.4.

1.3 土壤中放線菌的分離與純化

將土壤自然風(fēng)干，在28℃下放置5～7 d，用研缽磨細(xì).采用稀釋涂布法對(duì)土壤中的放線菌進(jìn)行分離，純化后的單菌落轉(zhuǎn)接到高氏一號(hào)斜面培養(yǎng)基上編號(hào)培養(yǎng)，保存待用.

1.4 平皿對(duì)峙法篩選拮抗放線菌

將PDA培養(yǎng)基融化后，倒入滅菌的平板中冷卻凝固，以平板原點(diǎn)為中心，中央接入直徑為6 mm的放線菌菌餅，其周圍等距離處接入3個(gè)直徑為6 mm的紋枯病菌菌餅(見圖1(b))，每處理3次重復(fù)，置于28℃恒溫箱中培養(yǎng)，5 d后測量各篩選菌菌落邊緣和紋枯病菌菌落邊緣之間的抑菌帶寬度.

1.5 抑菌譜的測定

以篩選到的抑菌作用最強(qiáng)的菌株作為目的菌株，與苦瓜枯萎病菌、小麥赤霉病菌、番茄葉霉病菌3種植物病原真菌進(jìn)行對(duì)峙培養(yǎng)，測定抑菌譜.

1.6 菌株形態(tài)特征、生理生化特征及培養(yǎng)特征的測定

待鑒定的菌株進(jìn)行插片培養(yǎng)，將所觀察到的形態(tài)結(jié)果顯微照相.培養(yǎng)特征及生理生化特征的測定參照文獻(xiàn)［10］，并記錄各項(xiàng)指標(biāo).

1.7 菌體DNA的提取、16S rDNA序列PCR擴(kuò)增及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

圖1 Sh-43菌株的菌落形態(tài)和對(duì)紋枯病菌的抑菌效果

按照上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司SK1201-UNIQ-10柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒說明書提取樣品的基因組 DNA.通用引物7f的序列為5'-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3'，1540r的序列為5'-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'.

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增程序?yàn)?98℃預(yù)變性5 min，95℃變性35 s，55℃復(fù)性35 s，72℃延伸1 min 30 s，35個(gè)循環(huán)擴(kuò)增;72℃延伸8 min.

PCR產(chǎn)物純化后經(jīng)上海生工生物工程技術(shù)有限公司完成測序.將測得的基因序列通過Blast程序與GenBank中核酸數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)進(jìn)行對(duì)比分析，并利用 MEGA4以 N-J法繪制系統(tǒng)發(fā)育樹.

2 結(jié)果與分析

2.1 放線菌菌株的獲得

在采集到的68份土樣中，利用稀釋涂布法，根據(jù)菌落形態(tài)、大小、色澤與生長速度等特征，分離純化得到了406株放線菌.

2.2 平皿對(duì)峙法篩選拮抗放線菌

利用平皿對(duì)峙法測定放線菌株對(duì)紋枯病菌的拮抗作用.結(jié)果表明:分離到的406株放線菌中共有42株對(duì)紋枯病菌有不同程度的抑制作用(見表1)，占分離菌株總數(shù)的10.3%，它們產(chǎn)生的生物活性物質(zhì)可對(duì)紋枯病菌起到抑制作用，靠近活性菌株一側(cè)的紋枯菌菌絲表現(xiàn)生長速度減弱;Sh-43菌株的抑菌效果最好，抑菌帶寬度為28.3 mm(見圖1).

表1 42株對(duì)水稻紋枯病菌有抑制作用的放線菌株

2.3 抑菌譜的測定

供試菌株的篩選結(jié)果表明，Sh-43菌株對(duì)紋枯病菌有較強(qiáng)的拮抗作用.利用對(duì)峙培養(yǎng)法測定Sh-43菌株的抑菌譜，結(jié)果如表2所示.由此可知，Sh-43菌株對(duì)苦瓜枯萎病菌、小麥赤霉病菌和番茄葉霉病菌這3種植物病原真菌也具有較強(qiáng)的拮抗作用.

2.4 Sh-43菌株形態(tài)特征、生理生化特征及培養(yǎng)特征的測定

菌株形態(tài)觀察結(jié)果表明，Sh-43菌株能夠在高氏一號(hào)培養(yǎng)基上生長，可形成氣生菌絲，氣生菌絲成熟后發(fā)育成孢子絲，孢子絲呈波曲或螺旋狀(見圖2).

表2 Sh-43菌株抑菌譜的測定結(jié)果

生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果(見表3)表明:Sh-43菌株可使明膠緩慢液化，可緩慢水解淀粉，牛奶不凝固，伏譜(V-P)實(shí)驗(yàn)呈陰性，可利用肌醇、麥芽糖、D-甘露醇、果糖、蔗糖、半乳糖、乳糖、可溶性淀粉等8種碳源.

圖2 Sh-43菌株的顯微特征(×400)

表3 Sh-43菌株生理生化特征的測定結(jié)果

2.5 16S rDNA序列及系統(tǒng)發(fā)育分析

Sh-43菌株基因組 DNA的提取結(jié)果見圖3.采用細(xì)菌的16S rDNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得一長度為1 388 bp的基因(見圖3)，序列測定由上海生工生物工程技術(shù)有限公司完成.

基于16S rDNA序列分析進(jìn)行細(xì)菌鑒定是國際上通用的鑒定技術(shù).一般認(rèn)為:16S rDNA序列同源性小于98%，可以認(rèn)為種不同;同源性小于93% ～95%，可以認(rèn)為屬不同［11］.將Sh-43菌株16S rDNA基因序列通過Blast比對(duì)分析，Sh-43菌株與吸水鏈霉菌的遺傳距離最小，同源性高達(dá)100%.基于16S rDNA基因序列建立的鏈霉菌屬系統(tǒng)發(fā)育樹見圖4.故將Sh-43菌株鑒定為吸水鏈霉菌(Streptomyces hygroscopicus).

圖3 Sh-43菌株的電泳分析圖

3 結(jié)論與討論

本研究通過對(duì)不同地區(qū)土樣中放線菌的分離篩選，獲得了一株拮抗紋枯病菌的Sh-43菌株.通過觀察菌株的形態(tài)和培養(yǎng)特征，分析其生理生化特性，根據(jù)文獻(xiàn)［12］確定Sh-43菌株為鏈霉菌屬，再結(jié)合菌株的16S rDNA序列的聚類分析結(jié)果，最后將其鑒定為吸水鏈霉菌(Streptomyces hygroscopicus).

圖4 基于16S rDNA基因序列建立的鏈霉菌屬(Streptomyces)系統(tǒng)發(fā)育樹

國內(nèi)已有不少有關(guān)應(yīng)用拮抗微生物防治紋枯病的研究報(bào)道.陳宏州等［13］從水稻根圍土樣中篩選得到對(duì)水稻紋枯病菌有顯著拮抗活性的放線菌菌株，其發(fā)酵濾液在稀釋10倍時(shí)對(duì)水稻紋枯病菌的抑菌活力達(dá)46.21%.鄭愛萍等［14］從健康的水稻植株、感染紋枯病水稻植株及根際土壤、秧田水、菌核上分離出了能拮抗紋枯病的細(xì)菌，從中挑選在實(shí)驗(yàn)室中作用效果明顯的菌株，對(duì)其分別進(jìn)行了抑菌率、致畸性、對(duì)菌核的萌發(fā)和形成的影響度等抗生性檢測，并在液培條件下檢測了其對(duì)水稻的出苗率、葉片及根系干質(zhì)量的促生性，結(jié)果表明在田間試驗(yàn)中混合3種菌處理有較好的防治效果.

生理生化實(shí)驗(yàn)顯示，吸水鏈霉菌Sh-43菌株對(duì)環(huán)境具有較強(qiáng)的適應(yīng)能力;抗菌譜測定結(jié)果表明，Sh-43菌株對(duì)真菌類病原菌表現(xiàn)出明顯的拮抗能力.吸水鏈霉菌Sh-43菌株對(duì)紋枯病菌產(chǎn)生明顯的抑菌圈，表明該菌可以合成某種抗菌物質(zhì)并釋放到周圍環(huán)境，其對(duì)紋枯病菌的生長和繁殖具有較強(qiáng)的抑制作用.因此，Sh-43菌株有希望作為生防菌用于水稻紋枯病的防治.但是，這些具有生物活性的抗菌物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能現(xiàn)在尚不清楚，正在進(jìn)一步的研究中.

［1］任春梅，高必達(dá)，何迎春.水稻抗紋枯病的研究進(jìn)展［J］.植物保護(hù)，2001，27(4):32-36.

［2］李洪剛.水稻紋枯病的診斷與防治［J］.農(nóng)村經(jīng)濟(jì)與科技，2001(8):34.

［3］Zeng Yuxiang，Ji Zhijuan，Ma Liangyong，et al.Advances in mapping loci conferring resistance to rice sheath blight and mining Rhizoctonia solani resistant resources［J］.Rice Science，2011，18(1):56-66.

［4］賴傳雅.農(nóng)業(yè)植物病理學(xué)［M］.華南本.北京:科學(xué)出版社，2003:21-27.

［5］于艷敏，趙北平，高洪儒，等.生防菌R13對(duì)水稻紋枯病病原菌的抑制作用［J］.黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010(1):3-4.

［6］農(nóng)倩，陳雪鳳，黎起秦，等.水稻內(nèi)生細(xì)菌B196的鑒定及其對(duì)水稻紋枯病的防治作用［J］.中國生物防治學(xué)報(bào)，2011，27(1):99-103.

［7］Zhang Chuanqing，Liu Yinghui，Ma Xinying，et al.Characterization of sensitivity of Rhizoctonia solani，causing rice sheath blight，to mepronil and boscalid［J］.Crop Protection，2009，28(5):381-386.

［8］但漢曙.赤壁市水稻紋枯病重發(fā)原因及防治對(duì)策［J］.湖北植保，2010(6):15.

［9］朱衛(wèi)剛，胡偉群，陳杰.噻呋酰胺與井岡霉素復(fù)配對(duì)防治水稻紋枯病的增效作用［J］.中國稻米，2011，17(2):54-55.

［10］中國科學(xué)院微生物研究所放線菌分類組.鏈霉菌鑒定手冊(cè)［M］.北京:科學(xué)出版社，1975.

［11］Fry N K，Warwick S，Saunders N A，et al.The use of 16S ribosomal RNA analyses to investigate the phylogeny of the family Legionellaceae［J］.Journal of General Microbiology，1991，137(5):1215-1222.

［12］瓦克斯曼S A.放線菌:第二卷屬和種的分類、鑒定和描述［M］.閻遜初，譯.北京:科學(xué)出版社，1974.

［13］陳宏州，楊敬輝，朱桂梅，等.水稻紋枯病菌拮抗放線菌的篩選與生防潛能評(píng)價(jià)［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009(5):141-143.

［14］鄭愛萍，李平，王玲霞，等.水稻紋枯病拮抗細(xì)菌的篩選及抗生性研究［J］.西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2001(1):78-81.