HPLC 法測定抗病毒口服液中苦參堿的含量

劉永勝，陳華，金偉華，范敏（.成都軍區總醫院藥劑科，成都60083；.成都醫學院藥學系，成都60083）

抗病毒口服液[1]是我科根據《中國人民解放軍醫療機構制劑規范》研制的中藥制劑，由山豆根、魚腥草、板藍根、青蒿、白芷、忍冬藤等組成。臨床上主要用于治療病毒性感冒，療效確切。山豆根是該口服液的主藥，來源于豆科植物越南槐（Sophora tonkinens Gapnep）的干燥根及根莖，具有清熱解毒、消腫利咽的功效，用于火毒蘊結、咽喉腫痛、齒齦腫痛的治療，為常用中藥，其主要化學成分為生物堿、黃酮和多糖等物質，其中生物堿在醫學上廣泛應用。苦參堿是山豆根的主要成分，具有多種藥理活性。為更好控制該制劑的產品質量和提高其藥品標準水平，筆者對其中的主要成分苦參堿含量測定方法進行了試驗研究。

1 儀器與試藥

Agilent 1200型高效液相色譜（HPLC）儀，包括四元泵、可變波長檢測器、Agilent 1200型化學工作站（美國安捷倫公司）；DU 730型紫外-可見分光光度計（美國貝克曼公司）；AL 204型電子天平（梅特勒-托利多儀器公司）；AP-01P型真空泵（天津奧特賽恩斯儀器公司）；SZ-97型自動三重純水蒸餾器（上海亞榮生化儀器廠）。

抗病毒口服液（成都軍區總醫院自制，10 mL/支×10瓶/盒，批號：110321A、110321B、110321C）；苦參堿對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110805-200507）；水為三重蒸餾水，乙腈、甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Eclipse XDB-C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-磷酸鹽緩沖液（pH 6.8，V/V＝25∶75）；流速：1.0 mL·min－1；柱溫：30 ℃；檢測波長：210 nm；進樣量：10 μL。理論板數按苦參堿計算不得低于2 000。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取經五氧化二磷減壓干燥至恒重的苦參堿對照品適量，加甲醇溶解并稀釋成苦參堿對照品貯備液（0.90 mg·mL－1），再精密量取適量，制成每1 mL含苦參堿0.09 mg的溶液，搖勻，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密量取抗病毒口服液20 mL，置于分液漏斗中，精密加入三氯甲烷20 mL，濃氨試液0.5 mL，搖勻，靜置至溶液分層，取下層液體，再重復上述操作2次。合并下層液體，轉移至蒸發皿中，40℃揮干，殘渣加甲醇適量使溶解，并轉移至10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.2.3 陰性對照溶液的制備 按處方比例配成缺山豆根藥材的陰性樣品，照“2.1.2”項下方法制備，取陰性對照液20 mL，置于分液漏斗中，用三氯甲烷萃取，過濾，干燥，即得。

2.3 系統適用性試驗

精密吸取對照品溶液、供試品溶液及陰性對照溶液各10 μL，注入HPLC儀測定，色譜見圖1。結果，陰性對照溶液在與苦參堿對照品溶液相對應的保留時間位置上未見吸收峰，說明陰性對照溶液無干擾。

圖1 高效液相色譜圖A.對照品；B.陰性對照；C.供試品；1.苦參堿Fig 1 HPLC chromatogramsA.substance control；B.negative sample；C.sample；1.martine

2.4 線性關系考察

分別精密量取苦參堿對照品貯備液（0.90 mg·mL－1）適量，加甲醇稀釋制成濃度0.18、0.09、0.036、0.018、0.009 mg·mL－1的溶液。分別精密吸取10 μL，注入HPLC儀，按“2.1”項下色譜條件記錄色譜圖。以苦參堿檢測濃度（X）為橫坐標，峰面積積分值（Y）為縱坐標，得回歸方程Y＝28 120X+64.207（r＝0.999 6）。結果表明，苦參堿檢測濃度在0.009～0.18 mg·mL－1濃度范圍內與峰面積積分值呈良好的線性關系。

2.5 精密度試驗

精密吸取濃度為0.090 mg·mL－1的對照品溶液10 μL，連續進樣6次，測定苦參堿峰面積。結果，苦參堿對照品峰面積RSD＝1.06%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.6 穩定性試驗

取同一批號樣品適量，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，室溫放置，于0、2、4、6、8、10 h分別進樣測定其峰面積。結果，苦參堿峰面積RSD＝1.47%（n＝3），表明樣品溶液在10 h內穩定性良好。

2.7 重復性試驗

取同一批號樣品適量，精密稱取6份，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，重復平行測定。結果，苦參堿平均含量為0.011 mg·mL－1，RSD＝1.68%（n＝6），表明重復性良好。

2.8 加樣回收率試驗

精密稱取同一批號（批號：101012，含量：0.115 3 mg）樣品約10 mL，各6份，在苦參堿線性關系的濃度范圍內，按供試樣品苦參堿原有含量約1∶1的比例，分別加入苦參堿對照品0.090 mg，再按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，分別測定苦參堿含量，并計算各自加樣回收率，結果見表1。

2.9 樣品含量測定

精密稱取3批供試品適量，按“2.1.2”項下方法制備成供試液，分別測定其苦參堿含量。結果，3個批號的供試品苦參堿含量分別為 0.011 53、0.011 89、0.011 75 mg·mL－1，RSD＝1.32%，表明供試樣品苦參堿含量穩定，樣品生產工藝成熟、穩定、可靠。

表1 加樣回收率試驗結果（n＝6）Tab 1Results of recovery test（n＝6）

3 討論

3.1 色譜柱選擇[2，3]

對于生物堿的HPLC法分析，通常采用離子對色譜，但平衡時間較長，不利于快速分析。2005年版《中國藥典》中采用氨基柱，能同時分析苦參堿和氧化苦參堿，但氨基柱不常用，且穩定性稍差。因此，筆者選擇了實驗室常用的耐高pH的C18柱。

3.2 測定波長選擇

根據參考文獻資料[4，5]和苦參堿的理化性質對檢測波長進行選擇，取苦參堿對照品溶液，在200～400 nm波長范圍內進行掃描，結果在205～207 nm波長處苦參堿有較強的吸收，最大吸收波長為206.8 nm，但是206.8 nm波長靠近紫外末端吸收區，干擾較大，影響苦參堿的含量測定。經驗證210 nm波長比較合適，干擾小且靈敏度高，吸收度能達到最大吸收波長206.8 nm的98.5%，故將苦參堿含量測定的檢測波長定為210 nm。

3.3 流動相的選擇

筆者曾采用甲醇-水系統作為流動相，結果發現很難檢出苦參堿，而采用甲醇-乙腈-磷酸鹽緩沖液系統，樣品中其他雜質與苦參堿未分離，最后用乙腈-磷酸鹽緩沖液（pH 6.8）可使苦參堿與樣品雜質分開，且峰形較好。因此，選擇該系統為流動相。

3.4 方法的選擇

2010年版《中國藥典》[6]載有抗病毒口服液，采用的是對連翹苷進行定量測定，而本制劑因處方與藥典處方不同，故對苦參堿進行含量測定。

綜上所述，本方法準確、靈敏度高、重復性好，可用于抗病毒口服液的質量控制。

[1]陳延清，張永嵩，尤 建，等.抗病毒顆粒（無糖型）的質量標準研究[J].中國中藥雜志，2000，25（4）：218.

[2]王 苑，曾榮仕，朱湛華.RP-HPLC法測定苦參中苦參堿的含量[J].中國藥房，2007，18（27）：2 124.

[3]夏學勵.HPLC法測定癬凈顆粒中苦參堿、氧化苦參堿的含量[J].中國藥房，2009，20（18）：1 420.

[4]葉秀金，宋粉云.HPLC法測定清肺抑火丸中苦參堿和氧化苦參堿含量[J].中國藥房，2011，22（12）：1 127.

[5]佘志華，文曉柯，吳雅麗.高效液相色譜法測定陰炎凈中苦參堿的含量[J].中南藥學，2008，6（5）：559.

[6]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（二部）[S].2010年版.北京：中國醫藥科技出版社，2010：758.