RP-HPLC 法測定卡鉑制劑中卡鉑的含量

張 萍，楊 慧，宋 梅，曹 丹（江蘇省徐州醫藥高等職業學校，江蘇徐州 221116）

卡鉑（Carboplatin，CBP）化學名為順-二氨-1，1-環丁烷二羧酸合鉑，屬第2代鉑類廣譜抗癌藥[1]，其抗瘤譜、療效和骨髓毒性均與順鉑相似，而胃腸道和腎毒較順鉑輕，臨床廣泛用于多種惡性腫瘤的治療。2000年版[2]、2005年版[3]、2010年版[4]《中國藥典》中以高效液相色譜（HPLC）法作為藥物卡鉑的含量測定方法，在該方法中均以水為流動相，這一點值得商榷。因為當小孔徑、端基封口良好的反相填料色譜柱使用接近100%的水為流動相時，有時會發生疏水坍塌現象，此現象是由流動相不浸潤固定相表面所致。同時，卡鉑的極性較強，極易與色譜柱未鍵合的硅羥基鍵合，從而導致峰的對稱性達不到藥典的要求，實際操作中其對稱性大大偏離藥典的規定，見圖1。為此，筆者對卡鉑含量的測定條件進行了研究，解決了上述問題。

1 儀器與試藥

Agilent 1200型HPLC儀，包括四元梯度泵、自動進樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測器（美國安捷倫公司）；CP 6201型萬分之一電子分析天平（德國賽多利斯公司）。

卡鉑對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：10322-0101，純度：99.99%）；卡鉑注射液（齊魯制藥有限公司，批號：9110102ES、9080082ES、9110204ES，規格：10 mL：100 mg/支）；注射用卡鉑（齊魯制藥有限公司，批號：9060081DA、9060082DA、9060083DA，規格：0.1g/支）；甲醇為色譜純（美國Merk公司，規格：4 L）；辛基磺酸鈉為色譜級試劑（Regal-Biotechnology Company、25 g）；水為超純水（石英亞沸蒸餾并用美國Millipore公司Milli-Q 50型超純水儀處理）；其他試劑均為分析純。

圖1 高效液相色譜圖A.以往色譜條件下卡鉑峰；B.新色譜條件下的卡鉑峰Fig 1 HPLC chromatogramsA.chromatographic peak in previous method；B.chromatographic peak in new method

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：SHIMADZU RP-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-水（含2.5 mmol·L－1辛基磺酸鈉，V/V＝10∶90）；流速：1.0 mL·min－1；進樣量：10 μL；柱溫：40 ℃；檢測波長：229 nm。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取卡鉑對照品10.1 mg，置于10 mL容量瓶中，用超純水溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品貯備液備用。

2.2.2 注射用卡鉑溶液的制備 取注射用卡鉑樣品（批號：9060081DA）約10 mg，精密稱定，置于100 mL容量瓶中，加入超純水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。進樣前取適量過0.45 μm微孔濾膜。

2.2.3 卡鉑注射液的制備 精密吸取卡鉑注射液樣品（批號：9110102ES）1 mL，置于100 mL容量瓶中，加入超純水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。進樣前，取適量過0.45 μm微孔濾膜。

2.2.4 陰性供試品溶液的制備 根據注射用卡鉑處方，取5.0 mg甘露醇置于100 mL容量瓶中，加超純水至刻度，即得注射用卡鉑陰性樣品溶液；根據卡鉑注射液處方取適量乙二胺四乙酸，注射用水溶解，稀釋即得卡鉑注射液陰性樣品溶液。

取標準品和供試品溶液進樣，結果卡鉑對照品中卡鉑的理論板數為7 384，對稱因子為0.96；注射用卡鉑及卡鉑注射液樣品中卡鉑的色譜峰與相鄰組分的色譜峰的分離度均＞1.5，理論板數分別為8 300、8 183，對稱因子分別為0.98、0.98。色譜見圖2。

圖2 高效液相色譜圖A.卡鉑對照品溶液；B.注射用卡鉑樣品溶液；C.卡鉑注射液溶液；D.注射用卡鉑陰性樣品溶液；E.卡鉑注射液陰性樣品溶液；1.卡鉑Fig 2 HPLC chromatogramsA.carboplatin solution control；B.Carboplatin for injection solution；C.Carboplatin injection solution；D.negative sample of Carboplatin for injection；E.negative sample of Carboplatin injection；1.carboplatin

2.3 線性關系考察

精密吸取已制備的1.01 mg·mL－1的卡鉑對照品貯備液適量，將其稀釋成濃度分別為0.505 0、0.252 5、0.101 0、0.050 5、0.025 25、0.010 1 mg·mL－1的卡鉑對照品溶液。按“2.1”項下色譜條件，分別進樣10 μL，每種濃度分別重復進樣3次，記錄峰面積，以各對照品的檢測濃度（C，μg·mL－1）為橫坐標，峰面積積分值（A）為縱坐標，進行線性回歸，得卡鉑回歸方程A＝7.018 1C+8.1957。結果表明，卡鉑檢測濃度在10.1～505.0 μg·mL－1范圍內與峰面積積分值呈良好的線性關系（r＝0.999 9）。

2.4 精密度試驗

取“2.2.1”項下濃度為0.101 mg·mL－1的卡鉑對照品溶液10 μL，按“2.1”項下色譜條件連續進樣6次，記錄峰面積積分值。結果，卡鉑的峰面積RSD＝0.81%，表明儀器精密度良好。

2.5 穩定性試驗

精密吸取“2.2.2”和“2.2.3”項下的供試品溶液適量，按“2.1”項下色譜條件每隔6 h進樣一次，共進樣9次，記錄峰面積積分值。結果，注射用卡鉑及卡鉑注射液樣品中卡鉑峰面積的RSD分別為0.89%、0.83%，表明樣品在48 h內穩定。

2.6 重復性試驗

分別精密取同一批號注射用卡鉑（批號：9060081DA）及卡鉑注射液（批號：9110102ES）樣品適量，各6份。按“2.2.2”和“2.2.3”項下供試品溶液制備方法制備，進樣10 μL，記錄峰面積和對稱因子。結果，注射用卡鉑及卡鉑注射液樣品中卡鉑峰面積的RSD分別為0.73%、0.80%，卡鉑對稱因子的RSD分別為0.96%、1.00%，表明重復性良好。

2.7 加樣回收率試驗

精密稱取已知含量的注射用卡鉑及卡鉑注射液供試品溶液適量，各9份，分別加入相當于樣品中卡鉑含量80%、100%、120%的對照品（各3個），按供試品溶液制備和測定方法操作，以回歸方程計算供試品中卡鉑的平均回收率，結果見表1、表2。

表1 注射用卡鉑的加樣回收率試驗結果Tab 1 Results of recovery tests of Carboplatin for injection

表2 卡鉑注射液的加樣回收率試驗結果Tab 2 Results of recovery tests of Carboplatin injection

2.8 樣品含量測定

分別取3批注射用卡鉑和卡鉑注射液藥品，按照“2.2.2”和“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，進樣測定，記錄峰面積，計算含量，結果見表3。

表3 注射用卡鉑和卡鉑注射液含量測定結果（n＝5）Tab 3 Results of content determination of Carboplatin for injection and Carboplatin injection（n＝5）

3 討論

3.1 方法的創新性

按照2000年版[2]、2005年版[3]、2010年[4]版《中國藥典》中卡鉑的色譜條件，卡鉑峰的對稱性達不到藥典的要求；本文所提出的色譜條件能很好地解決這一問題，并通過有機相的加入，延長了色譜柱的使用時間。

3.2 溶劑的選擇

由于卡鉑溶劑水溶性好而脂溶性差，故本試驗以水為溶劑，分離效果較好。

3.3 流動相的選擇

卡鉑藥品成分單一，雜質含量較少，在反相色譜條件下，出峰時間短，故等梯度洗脫應該可以滿足需要。在水相流動相中加入離子對試劑辛基磺酸鈉可以較好的改善峰形，以滿足藥典對峰對稱性的要求。在滿足對稱性和理論板數的同時適當加入少量甲醇改善純水的流動相環境，從而更有利于色譜柱的保養。

3.4 檢測波長的選擇

很多文獻報道用反相高效液相色譜（RP-HPLC）法測定卡鉑藥物制劑中卡鉑的含量[5～11]，但對于流動相的選擇和對稱性的問題并沒有過多關注。本研究所用HPLC儀配有二極管陣列檢測器，通過對卡鉑標準品進行全紫外波長的掃描，確定了229 nm為檢測波長，這也與報道一致[6]。本文采用RP-HPLC法在229 nm波長處測定了卡鉑藥品中卡鉑的含量，結果表明該方法迅速、可靠、重復性好，能同時滿足含量測定中對流動相、對稱性和理論板數的要求，經實驗室驗證，具有較好的實用性且易于推廣應用，適用于卡鉑制劑中卡鉑含量的測定。

[1]劉 放，黃衛平.卡鉑及其制劑的含量測定和穩定性實驗[J].中國醫院藥學雜志，1997，17（9）：403.

[2]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（二部）[S].2000年版.北京：化學工業出版社，2000：136-137.

[3]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（二部）[S].2005年版.北京：化學工業出版社，2005：108-109.

[4]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（二部）[S].2010年版.北京：中國醫藥科技出版社，2010：134.

[5]李 杰，王景萍，周麗莉，等.卡鉑血藥濃度高效液相色譜分析[J].醫院論壇雜志，2004，20（25）：23.

[6]李 杰，王景萍，周麗莉，等.高效液相色譜法同時測定人血清中卡鉑、假尿苷含量[J].中國藥學雜志，2005，40（9）：691.

[7]朱自強，王斐珍.卡鉑及其制劑含量測定方法的探討[J].浙江省醫學科學院學報，1996，7（3）：32.

[8]蔡 梅，徐薇薇.高效液相色譜法測定注射用卡鉑和奈達鉑的含量[J].海峽藥學，2007，1（19）：22.

[9]杜春雙，陳 琛，宋曉坤，等.卡鉑注射液的含量測定及其臨床使用穩定性研究[J].中國藥房，2011，22（5）：442.

[10]周立霞，哈敏文.貝伐單抗聯合培美曲賽加卡鉑二線治療晚期非小細胞肺癌的臨床觀察[J].中國藥房，2011，22（6）：529.

[11]陳百松，朱小勇，郭銀紅.紫杉醇聯合卡鉑二線治療進展期胃癌的療效觀察[J].中國藥房，2010，21（40）：3 797.