HPLC 法測定肺結核患者血漿中利福噴丁的濃度

劉會民，張 潔，高金泉，吳 狄（天津市海河醫院，天津 300350）

利福噴丁為利福霉素類藥物的衍生物，其抗結核分枝桿菌活性比利福平強2～10倍[1]，利福噴丁的最低抑菌濃度（MIC）較利福平普遍低2～4倍[2]，如使利福噴丁血藥濃度保持較高水平，對于耐藥的結核患者應用利福噴丁治療仍有一定療效[3]。目前利福噴丁臨床上經常使用0.45 g，每周2次，為了解改變用藥方案后利福噴丁是否能達到藥物治療濃度，筆者建立以高效液相色譜法測定利福噴丁血藥濃度的方法，為臨床采用合理的給藥時間提供試驗依據。

1 材料

1.1 儀器

LC-10A高效液相色譜儀，包括LC-10A泵、SPD-10A紫外-可見檢測器（日本島津公司）；N-2000色譜工作站（浙江大學智能工程研究所）；KDC-16H型高速離心機（科大創新股份有限公司中佳分公司）。

1.2 試藥

利福噴丁標準品（無錫山禾集團第一制藥有限公司，含量：92.6%，批號：200507046）；內標：對硝基酚（天津市光復精細化工研究所，含量：100%，批號20040706）；甲醇、色譜水為色譜純，冰乙酸為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Shim-pack VP-ODS（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：甲醇-水（70∶30，用冰乙酸調節至pH＝6）；流速：1.0 mL·min－1；檢測波長：336 nm；進樣量：20 μL。

2.2 血漿樣品處理

用加液器準確吸取40 μL含藥血漿于帶蓋塑料小試管內，加入內標液200 μL，混勻，靜置5 min后，于高速離心機（10 000 r·min－1）離心5 min，取上清液于450 μm濾頭過濾后取20 μL進樣分析。色譜圖詳見圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.空白血漿；B.空白血漿+內標；C.血漿樣品；1.對硝基酚；2.利福噴丁Fig 1 HPLC chromatogramsA.blank plasma；B.blank plasma+internal standard；C.plasma sample；1.d-nitrophenol；2.rifapentine

2.3 標準曲線的制備

取空白血漿1 mL，加入適量利福噴丁標準品溶液，制得含藥血漿，使其濃度分別為 0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、10.0、16.0、32.0 μg·mL－1。按“2.2”項下方法處理，進樣測定，記錄色譜峰面積，用峰面積對內標峰面積的比值（Y）作縱坐標，血漿樣品的濃度（X）作橫坐標進樣線性回歸，得利福噴丁回歸方程Y＝9.54X+1.5（r＝0.999 6）。結果表明，利福噴丁血藥濃度在0.25～32.0 μg·mL－1范圍內線性關系良好（r＝0.999 6），最低檢測限0.25 μg·mL－1。

2.4 精密度及回收率試驗

將配制的利福噴丁濃度分別為0.5、4、16 μg·mL－1的標準血樣，按“2.2”項下方法操作，測定其日內和日間RSD及回收率，結果見表1。

表1 精密度及回收率試驗結果（n＝5）Tab 1Results of precision and recovery test（n＝5）

2.5 藥物干擾試驗

本文選用了臨床常與利福噴丁合用的抗結核藥，如異煙肼、吡嗪酰胺、乙胺丁醇等藥物進行觀察，除利福平在內標和利福噴丁之間出峰（并不影響利福噴丁的色譜峰）外，其他藥物也均未見干擾利福噴丁的色譜峰，說明本法有較強專屬性。

2.6 臨床應用

2.6.1 病例選取：選取26名應用利福噴丁的肺結核患者，應用劑量為450 mg，每周2次，分別在患者服藥后72、96 h時抽取患者血液1 mL，與肝素混合抗凝后，4 000 r·min－1離心10 min，分離血漿，按“2.2”項下方法操作，并計算結果。

2.6.2 藥物濃度監測結果：共監測患者26例，其中男性∶女性＝22∶4；年齡在21～79歲之間，平均年齡52.88歲。在72 h時，23例有藥物濃度檢出，濃度范圍在0.07～6.83 μg·mL－1之間，96 h時的藥物濃度有15例未檢出，最高濃度2.55 μg·mL－1。根據藥物濃度，9例患者將藥物服法改為450 mg，q72h，3例患者停用利福噴丁，改用其他抗結核藥治療。

3 討論

本文所建立的利福噴丁血藥濃度的測定方法具有專屬性強、快速準確等優點。處理樣品采用甲醇沉淀蛋白后高速離心，取上清液直接進樣，和液-液提取比較，藥物損失少，簡化了處理方法。文獻報道[4]選用利福平為內標，但利福平易遇光分解，本文選用對硝基酚為內標，該物質結構穩定，易于獲得，出峰快，與藥峰分離較好。采用甲醇-水作為流動相價廉易得，對高效液相色譜儀流路部件損害小，因此，本方法具有較高的臨床應用價值。

抗結核藥經吸收入血后，在病灶部位需要達到一定的濃度才能起到抑制或殺滅結核桿菌的作用，藥物濃度低很可能誘發耐藥，濃度過高會增加藥物毒副作用[5]。本文26例肺結核患者中，通過監測利福噴丁的血藥濃度，其中9例縮短了給藥時間，2例另改他藥治療。因此，利福噴丁在臨床應用時，需要進行血藥濃度監測，才能保證藥物達到臨床合理用藥，減少耐藥性的發生。

[1]陳新謙，金有豫，湯 光.新編藥物學[M].第17版.北京：人民衛生出版社，2011：108.

[2]端木宏謹，劉宇紅，姜廣路，等.結核分枝桿菌對利福噴丁與利福平交叉耐藥的實驗研究[J].中華結核和呼吸雜志，2005，28（3）：192.

[3]趙黎黎，馬海戰，曹文利，等.利福噴丁治療耐利福平肺結核80例臨床療效觀察[J].中國防癆雜志，2006，28（4）：244.

[4]黃必義，鄧立東.RP-HPLC法測定人血漿中利福噴丁的濃度[J].中國藥師，2005，8（2）：129.

[5]任麗娟，王 麗，羅小祥.治療藥物監測在抗結核藥物治療中的應用[J].中國藥房，2008，19（23）：1 827.