中國廣西人白細胞介素－21基因rs2221903 T／C遺傳多態性研究＊

藍 艷 余艷蓉 王春芳 韋葉生 韋傳東 王俊利 黃照權

藍 艷1，余艷蓉2，王春芳3，韋葉生3，韋傳東3，王俊利3，黃照權4，＊

廣西壯族自治區百色市右江民族醫學院附屬醫院，百色533000； 1皮膚科； 2燒傷外科； 3檢驗科； 4病理科； ＊通訊作者

白細胞介素－21 （Interleukin－21，IL－21）是一種新近發現的I類細胞因子，主要由活化的CD4＋T細胞產生，能夠調節體液和細胞介導的免疫應答，促進T細胞增殖分化，調節B細胞的增殖與調亡，增強NK細胞的細胞毒性作用［1～3］。此外，IL－21還具有抗腫瘤作用，與其它細胞因子、疫苗等聯合應用，有增強其抑制腫瘤細胞生長的功能［4］。IL－21 基因定位于人4號染色體長臂上（4q26～27），轉錄一條由642個核苷酸組成的成熟mRNA，編碼162個氨基酸組成的蛋白前體，其中前31個氨基酸為信號肽，后131個氨基酸組成具有四螺旋結構域，相對分子質量為15k D。目前，有關IL－21基因rs2221903 T／C多態性的研究國內外較少文獻報道。因此，本文采用單堿基延伸PCR技術，研究廣西地區199例健康人群中IL－21基因單核苷酸多態性（SNP），并與人類基因組計劃（Hap map）公布的4組人群（歐洲人、非洲人、日本人和中國北京人）的SNP分型數據進行比較，以探討IL－21基因多態性在不同種族正常人群中的分布差異，為人類學及群體遺傳學研究提供前瞻性基礎資料。

1 資料與方法

1.1 實驗對象

隨機選取廣西地區無血緣關系，在廣西右江民族醫學院附屬醫院體檢健康人群199例，其中男118例，女81例，年齡25～86歲，各項臨床及實驗室檢查指標均正常。

1.2 實驗方法

1.2.1 基因組DNA提取：采集以上人群靜脈血2 ml，用EDTA－K2抗凝；采用已建立的改良碘化鈉法［5］提取白細胞基因組DNA，－70℃保存備用。

1.2.2 引物設計與合成：根據IL－21基因rs2221903 T／C位點多態性和已知的DNA序列設計PCR引物，由上海天昊生物科技有限公司合成。用于特異性擴增IL－21基因包含rs2221903 T／C位點堿基的DNA片段的引物，上游引物序列為：5’－TGG ACA CTG ACG CCC ATA TTG A－3’，下游引物序列為：5’－AAG GCA GTT TAG TGG YGA CAG C－3’，延 伸 引 物 為：5’－TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTG CTC TGC TGC TTG CAG AAC A－3’。1.2.3 PCR 擴增：IL－21的 PCR擴增反應體系為20μl，其中含10×PCR 緩沖液2.0μl，0.3 mmol／L d NTPs 2.0μl，上、下游引物各1.0μl，模板 DNA 1.0μl，Taq DNA聚合酶1.0 U，不足體積用滅菌雙蒸水補足。PCR擴增程序：95℃預變性2 min，94℃變性20s，65℃退火40s，72℃延伸1.5 min，11個循環；94℃變性20s，59℃退火30s，72℃延伸1.5 min，24個循環；72s延伸2 min，4℃保存。PCR產物用Qiagen公司的Hot Star Taq進行多重PCR獲得，經蝦堿酶（SAP）（pro mega公司，美國）和外切酶I（EXOI）（Epicentre公司，美國）純化后用 ABI公司的SNa PshoTMultiplex Kit進行延伸反應。PCR延伸程序：96℃預變性1 min，96℃變性10s，50℃退火5s，60℃延伸30s，28個循環，4℃保存。延伸產物測序：取0.5μl延伸產物，用SAP純化，95℃變性5 min后上ABI 3130 XL測序儀進行測序，測序結果見圖1。SNP 分型用 Gene Mapper4.0（Appliedbiosyste ms）分析。

1.3 統計學處理

采用SPSS 11.5軟件包進行統計分析。基因型和等位基因頻率采用基因直接計數法計算，各組間基因型及等位基因頻率比較采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 廣西人IL－21基因型檢測結果

IL－21基因rs2221903 T／C多態性，PCR擴增產物片段大小為230bp。經ABI 3130XL基因檢測儀SNP分型，結果顯示廣西人IL－21基因rs2221903 T／C位點檢測到TT、TC和CC三種基因型。

2.2 廣西人IL－21基因多態性分布

IL－21基因rs2221903 T／C位點的基因型及等位基因頻率符合Hardy－Weinberg遺傳平衡，說明所選研究樣本具有群體代表性。其中rs2221903 T／C位點基因型以TT型最為常見，占75.38%；其等位基因以T型頻率最高，占87.19%。其基因型頻率分布的男女性別間比較無統計學差異（P＞0.05），見表1。

2.3 IL－21基因多態性在不同種族人群中的分布比較

將廣西人IL－21基因rs2221903 T／C多態性分布頻率與人類基因組計劃 （htt p：／／www.ncbi.nl m.nih.gov／projects／SNP／）公布的歐洲人、非洲人、日本人和中國北京人的SNP分型數據進行比較，發現中國廣西人基因型及等位基因的分布頻率與歐洲人和非洲人比較具有統計學差異（P＜0.05），而與日本人和中國北京人比較差異無統計學意義（P＞0.05）；與中國安徽人［6］比較差異亦無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

圖1 IL－21基因rs2221903 T／C測序圖

表1 IL－21基因型及等位基因頻率在廣西地區人群中的分布（n，%）

表2 不同種族及地區人群IL－21基因rs2221903 T／C多態性分布頻率比較（n，%）

3 討 論

隨著人類基因組研究的進展，已經認識到不同的基因背景可以造成人們對某些疾病不同的易感性。通過對人類基因多態性的研究可以了解各種基因的不同基因型在人群中的分布，有助于從基因水平更深刻地闡明各種疾病在不同種族、不同人群中存在不同發病率和不同臨床表現、臨床特點的內在機制。因此，基因多態性的研究是解釋多種疾病臨床表現多樣化的一個有用工具。而在對一些致病基因的多態性分布進行研究時，首先了解其在正常人群中的分布特點是正確分析基因多態性與疾病之間關系的前提條件。

IL－21是一類由激活的CD4＋T細胞和自然殺傷T細胞（NKT）分泌產生的I型細胞因子，大量研究發現，IL－21是一個重要的免疫調節分子，通過與其受體（IL－21R）特異性結合而發揮廣泛的生物學作用，如抗病毒、抗腫瘤、調節免疫應答等［7～9］。IL－21基因位于4號染色體長臂上（4q26～27），包括5個外顯子和4個內含子，IL－21基因存在單核苷酸多態性，這種基因多態性可能影響IL－21基因的功能，進而可能影響到IL－21基因多態性與相關疾病的發生發展。Ding等［6］和Sawalha等［10］研究發現，IL－21基因多態性與系統性紅斑狼瘡發病顯著相關。Jia等［11］研究發現，在格雷夫斯（氏）病患者中，IL－21等位基因及單倍體與該病發生顯著相關。此外，國外學者的研究表明，IL－21基因多態性在I型糖尿病及反復自發性流產發病的遺傳因素中起重要作用［12，13］。因此，正確分析和闡明IL－21基因多態性在不同種族和地域人群中的分布特點，為進一步研究不同人群中IL－21基因多態性與某些疾病發生發展之間的關系提供理論依據和分子遺傳學基礎。

本文應用單堿基延伸PCR技術檢測了廣西地區正常人群中IL－21基因rs2221903 T／C位點多態性的分布情況，結果顯示，在所觀察人群中，rs2221903 T／C位點表現出TT、TC和CC三種基因型，以TT型最為常見（75.38%），其等位基因以T最為常見（87.19%）。進一步分析發現，IL－21基因rs2221903 T／C位點基因型分布頻率男女組間比較差異無統計學意義（P＞0.05），提示該位點基因型分布頻率與性別無關。將中國廣西地區人與歐洲人、非洲人、日本人、中國北京和安徽等人群基因多態性研究結果比較發現，廣西健康人群中IL－21基因rs2221903 T／C位點T等位基因頻率（87.19%）顯著高于歐洲人（63.72%）、顯著低于非洲人（95.58%），差異具有統計學意義（P＜0.05）；而與日本人、中國北京人及安徽人比較差異無統計學意義。從本文結果可以看到，IL－21基因型分布及等位基因頻率在不同種族間存在著明顯的差異，這一結果符合遺傳學規律，即親緣關系越近，其基因型分布越相似，反之差異越顯著。

綜上所述，對中國廣西人IL－21基因rs2221903 T／C多態性的研究，不僅有利于認識臨床上與IL－21基因相關的多種疾病在不同種族和地域表現出來的差異，而且進一步為人類學及群體遺傳學的研究和基因多態性普查奠定了基礎，并為疾病前瞻性研究提供了重要的分子遺傳學數據。

致謝：感謝上海天昊生物科技有限公司丁達和劉燕兩位博士在實驗過程中給予的大力支持和幫助！

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