白介素－23受體基因多態(tài)性與乙肝相關(guān)肝細(xì)胞癌的易感性研究＊

彭契六 覃彥平 易 珍 覃錦耀 謝 麗 李 山，＃ 秦 雪，＃

彭契六1，覃彥平2，易 珍1，覃錦耀1，謝 麗1，李 山1，＊，秦 雪1，＊

1廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，南寧530021； 2廣西柳州市紅十字會(huì)醫(yī)院檢驗(yàn)科，柳州545001； ＊通訊作者

肝細(xì)胞癌（Hepatocell ular Carcino ma，HCC）是廣西地區(qū)壯族人群高發(fā)惡性腫瘤［1］，乙型肝炎病毒（HBV）慢性感染、黃曲霉毒素污染和飲用污水被認(rèn)為是廣西肝癌的重要危險(xiǎn)因素［2］，但其確切機(jī)制尚未闡明。大量流行病學(xué)研究提示，慢性炎癥感染與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［3，4］。乙肝相關(guān)HCC屬于經(jīng)典的炎癥伴隨腫瘤，炎癥在乙肝相關(guān)HCC的發(fā)生發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用［5］。白細(xì)胞介素23（IL－23）是一個(gè)擁有異二聚體結(jié)構(gòu)的前炎癥因子，可刺激人體內(nèi)T細(xì)胞的增殖和γ－干擾 素 （IFN－γ）的 產(chǎn) 生；IL－23／IL－23 受 體 （IL－23R）參與Th17細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)。Th17細(xì)胞是一類重要的CD4＋T細(xì)胞亞群，主要通過(guò)分泌IL－17 A等促炎因子參與炎癥免疫反應(yīng)。多項(xiàng)研究表明，IL－23 R基因多態(tài)性與多種炎性疾病如克羅恩病、炎性腸病以及銀屑病等遺傳易感性相關(guān)［6～8］。但與乙肝背景下炎性HCC是否相關(guān)，目前尚無(wú)定論。為此，本研究應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)－限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（PCR－RFLP）技術(shù)檢測(cè)了廣西地區(qū)壯族人群乙肝表面抗原（Hbs Ag）陽(yáng)性的 HCC患者IL－23R基因多態(tài)性，旨在探索IL－23 R基因多態(tài)性與 HCC的關(guān)系，為進(jìn)一步研究HCC的發(fā)病機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

所有研究對(duì)象均為相互間無(wú)血緣關(guān)系的廣西地區(qū)壯族人群，選擇2011年1月～7月在廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院就診和治療的經(jīng)肝組織病理學(xué)診斷為HCC、HBs Ag陽(yáng)性且無(wú)其它器官惡性腫瘤史的患者作為病例組，病例組所有患者均未經(jīng)化療、放療，無(wú)年齡限制；選同期來(lái)自該院健康體檢，無(wú)腫瘤病史的HBs Ag陽(yáng)性者作為對(duì)照組。兩組均排除丙肝病毒（HCV）感染和其它原因?qū)е碌母闻K病變，如酒精性及代謝性肝病等。所有研究對(duì)象均采集外周血標(biāo)本2 ml，EDTA抗凝，采集后立即置4℃保存?zhèn)錂z。本研究經(jīng)廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有樣本均在患者簽署書(shū)面知情同意書(shū)后收集。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器

引物由上海生工生物有限公司合成；Dream Taq TM Green PCR Master Mix（2x）試劑盒和限制性內(nèi)切酶Mnll、HaeⅢ均由美國(guó)Fer mentas公司提供；Marker DP500TM由大連寶生物工程有限公司生產(chǎn)；溴化乙錠（EB）由美國(guó)Promega公司生產(chǎn)，北京普洛麥格生物技術(shù)有限公司提供；瓊脂糖由北京普博斯生物科技有限公司提供。

PCR核酸擴(kuò)增儀（DA－7600型）由中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司生產(chǎn)；電泳儀由北京六一儀器廠生產(chǎn)；全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)為美國(guó)GENEGENIUS公司產(chǎn)品；高速低溫離心機(jī)（RS－20型）為日本TOMY公司產(chǎn)品；雙波長(zhǎng)紫外分光光度計(jì)為美國(guó)PE公司產(chǎn)品；電子分析天平為日本津?qū)Ч井a(chǎn)品；低溫冰箱為中國(guó)海爾公司產(chǎn)品；恒溫水浴箱為上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品。

1.3 研究方法

1.3.1 基因組DNA提取：采用酚－氯仿抽提法提取全血基因組DNA。

1.3.2 引物設(shè)計(jì)與合成：參照有關(guān)文獻(xiàn)［3，9，10］設(shè)計(jì)3對(duì)引物，由上海生工生物有限公司合成。用于特異性 擴(kuò) 增 IL－23 R 基 因 rs10889677、rs1884444、rs11465817。3個(gè)位點(diǎn)的引物序列見(jiàn)表1。

表1 IL－23 R基因多態(tài)性引物序列及反應(yīng)條件

1.3.3 PCR擴(kuò)增：IL－23R 的 PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系為25μl，其 中 含 10×PCR Buffer 2.5μl，2.5 mmol／L d NTPs 2.0μl，引物P1、P2各20 p mol，模板DNA 5.0μl，Taq DNA聚合酶1.25 U，不足體積用滅菌雙蒸水補(bǔ)足。置熱循環(huán)儀（DA－7600型）中94℃預(yù)變性2 min；再按下列程序循環(huán)36次，即94℃變性30s，62.8℃／56℃／54℃ 退火 30s，72℃ 延伸30s；末次循環(huán)后，72℃ 延伸10 min。IL－23R 基因rs10889677、rs1884444、s11465817各位點(diǎn)的退火溫度見(jiàn)表1。

1.3.4 擴(kuò)增產(chǎn)物酶切：取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10μl，10 U限制性內(nèi)切酶（美國(guó)Fer mentas公司）于37℃酶切16h，反應(yīng)終止后，消化片段在3%瓊脂糖凝膠上電泳，EB染色后經(jīng)紫外燈判斷結(jié)果并拍照。

1.3.5 基因型鑒定：為保證基因型檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，隨機(jī)抽取每個(gè)位點(diǎn)10%的樣本送至上海生工生物有限公司進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。測(cè)序儀器為ABI－PRISM3730，采用Chromas軟件分析DNA測(cè)序結(jié)果。酶切結(jié)果和測(cè)序結(jié)果吻合率均達(dá)100%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

以χ2檢驗(yàn)比較人口學(xué)特征、吸煙和飲酒狀況以及IL－23R 3個(gè)位點(diǎn)各基因型和等位基因頻率在病例組和對(duì)照組之間分布的差異；采用擬合優(yōu)度χ2檢驗(yàn)對(duì)對(duì)照組的基因型分布進(jìn)行 Hardy－Weinberg平衡檢驗(yàn)，非條件Logistic回歸模型計(jì)算比值比（Odds Ratios，OR）及其95%可信區(qū)間（ConfidenceIntervals，CI）表示相對(duì)危險(xiǎn)度，采用 SHEsis軟件推算IL－23R基因多態(tài)性3個(gè)位點(diǎn)單體型頻率在病例組和對(duì)照組中的分布。所有統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)均為雙側(cè)概率檢驗(yàn)，所有數(shù)據(jù)分析均使用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 病例組和對(duì)照組臨床資料比較

病例組和對(duì)照組臨床資料比較見(jiàn)表2，兩組性別、吸煙史和飲酒史構(gòu)成比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；病例組≥50歲患者的構(gòu)成比高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝15.165，P＜0.01）。

表2 病例組與對(duì)照組臨床資料比較（n，%）

2.2 IL－23R基因型分析

IL－23 R基因rs10889677位點(diǎn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小為216bp，根據(jù)限制性內(nèi)切酶 Mnll酶切片段情況，其基因型有3種：AA型（216bp 1條帶）、AC型（216bp、154bp、62bp 3條帶）和 CC型（154bp、62bp 2條帶）；IL－23 R基因rs1884444位點(diǎn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小為132bp，根據(jù)限制性內(nèi)切酶HaeⅢ酶切片段情況，基因型有3種：TT型（132bp 1條帶）、TG型（132bp、106bp、26bp 3條帶）和 GG 型（106bp、26bp 2條帶）；IL－23R 基因rs11465817位點(diǎn) PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小為136bp，根據(jù)限制性內(nèi)切酶HaeⅢ酶切片段情況，基因型有3種：AA型（136bp 1條帶）、AC 型 （136bp、117bp、19bp 3 條 帶），CC 型（117bp和19bp 2條帶）。

2.3 對(duì)照組基因型分布頻率

對(duì)照 組 IL－23R 基 因 rs10889677、rs1884444、rs11465817各基因型Har dy－Weinberg平衡吻合度檢驗(yàn)結(jié)果表明，各基因型分布頻率均符合Hardy－Weinber g遺傳平衡定律（P＞0.05），說(shuō)明研究對(duì)象具有群體代表性。

2.4 IL－23R各基因型、等位基因頻率分布與HCC的關(guān)系

IL－23R 基 因 rs10889677、rs11465817 位 點(diǎn)AA、AC、CC基因型和A、C等位基因頻率在病例組和對(duì)照組中的分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；病例組IL－23 R基因rs1884444位點(diǎn)TG基因型頻率高于對(duì)照組（χ2＝6.798，P＜0.05），T、G等位基因頻率在兩組中分布差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （χ2＝4.330，P＜0.05）。見(jiàn)表3。

2.5 IL－23R基因多態(tài)性與 HCC風(fēng)險(xiǎn)

在調(diào)整了性別、年齡、吸煙史、飲酒史等環(huán)境危險(xiǎn)因素條件下，非條件Logistic回歸模型分析結(jié)果顯示，IL－23R 基因rs10889677、rs11465817位點(diǎn)攜帶AC、CC基因型個(gè)體與HCC患病風(fēng)險(xiǎn)無(wú)相關(guān)性（P＞0.05），rs1884444位點(diǎn)攜帶TG基因型個(gè)體罹患 HCC風(fēng)險(xiǎn)增加（校正 OR＝2.20，95%CI＝1.11～4.37，P＜0.05），GG基因型與患病風(fēng)險(xiǎn)無(wú)相關(guān)性（P＞0.05）。見(jiàn)表4。

表3 病例組和對(duì)照組IL－23 R基因各基因型、等位基因頻率分布（n，%）

表4 IL－23 R基因多態(tài)性與HCC風(fēng)險(xiǎn)的非條件Logistic回歸分析

2.6 單體型分析

使用SHEsis軟件對(duì)IL－23 R基因rs10889677、rs1884444、rs11465817 3個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行單體型構(gòu)建發(fā)現(xiàn)其存在 CGC、CGA、CTC、CTA、AGC、AGA、ATC、ATA等8種單倍體，病例組與對(duì)照組AGC單倍體分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；調(diào)整了性別、年齡、吸煙史、飲酒史等環(huán)境危險(xiǎn)因素的非條件Logistic回歸分析結(jié)果顯示，AGC單體型攜帶者較其它非ATA單體型攜帶者發(fā)生HCC的風(fēng)險(xiǎn)明顯提高（校正OR＝2.71，95%CI＝1.06～6.93，P＜0.05）。見(jiàn)表5。

3 討 論

本研究首次探討了廣西地區(qū)HBs Ag陽(yáng)性壯族人群IL－23R基因rs10889677、rs1884444、rs11465817位點(diǎn)多態(tài)性與HCC遺傳易感性的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)IL－23 R rs1884444 TG基因型可增加HCC的患病風(fēng)險(xiǎn)。進(jìn)一步對(duì)HCC組和對(duì)照組進(jìn)行單體型構(gòu)建分析發(fā)現(xiàn)存在 CGC、CGA、CTC、CTA、AGC、AGA、ATC、ATA等8種單倍體，且HCC組與對(duì)照組相比，AGC單體型分布差異明顯，提示該單倍體和與其關(guān)聯(lián)的多態(tài)性位點(diǎn)可能存在協(xié)同效應(yīng)，增強(qiáng)IL－23R的轉(zhuǎn)錄或表達(dá)，從而增加HCC的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。

表5 HCC組和對(duì)照組IL－23R基因3個(gè)位點(diǎn)構(gòu)成的單體型頻率分布

IL－23／Th17細(xì)胞免疫軸是機(jī)體炎癥免疫的重要組成部分。炎癥反應(yīng)涉及一系列促炎細(xì)胞因子、抑炎細(xì)胞因子以及多種趨化因子。有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)［11］表明促炎細(xì)胞因子對(duì)維持慢性炎癥、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生成、腫瘤微環(huán)境擴(kuò)張和抑制腫瘤免疫監(jiān)視等具有重要作用，特別是近幾年發(fā)現(xiàn)的IL－23／IL－23R通路對(duì)維持Th17細(xì)胞表型穩(wěn)定、促進(jìn)其增殖以及細(xì)胞分泌等發(fā)揮重要作用［12］。Th17細(xì)胞是繼Th1和Th2細(xì)胞系之后的第3類CD4＋Th細(xì)胞群，可分泌大量促炎因子如IL－17 A、IL－17F、IL－6、腫瘤壞死因子α（TNF－α）以及IL－25（IL－17E）等參與組織慢性炎癥，其介導(dǎo)的免疫反應(yīng)對(duì)抵抗外來(lái)病原體以及參與多種自身免疫性疾病過(guò)程發(fā)揮了重要作用。除此之外，有研究［13］揭示IL－23可以阻止 CD8＋T 細(xì)胞浸潤(rùn)腫瘤組織，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞逃避免疫監(jiān)視。

乙肝背景下HCC屬于經(jīng)典的炎癥伴隨腫瘤，炎癥貫穿于乙肝相關(guān)HCC的從始至終。本研究結(jié)果顯示IL－23R rs1884444位點(diǎn)基因多態(tài)性與HCC易感性相關(guān)，表明IL－23R基因可能與某些炎癥相關(guān)腫瘤的易感性相關(guān)。rs1884444位點(diǎn)位于IL－23 R第二外顯子，主要負(fù)責(zé)編碼IL－23R信號(hào)肽［14］。目前rs1884444的功能仍不明確，在線SNP分析工具Pupasuite3軟件 （http：//pupasuite.bioinf o.cipf.es/）分析顯示，rs1884444基因多態(tài)性可能干擾外顯子剪接增強(qiáng)子的作用，導(dǎo)致外顯子跳躍和錯(cuò)誤剪接等。另一種可能的原因是該位點(diǎn)T→G突變導(dǎo)致mRNA穩(wěn)定性增強(qiáng)，上調(diào)IL－23R表達(dá)，誘導(dǎo)Th1向Th17分化，大量分泌IL－17促進(jìn)其它細(xì)胞因子合成增多，引起炎性免疫反應(yīng)增強(qiáng)，從而提高某些炎性疾病如克羅恩病、炎性腸病和HCC的發(fā)病易感性。

綜上所述，本研究通過(guò)病例－對(duì)照設(shè)計(jì)發(fā)現(xiàn)IL－23 R rs1884444基因多態(tài)性，TG基因型可能與廣西地區(qū)HBs Ag陽(yáng)性壯族人群HCC遺傳易感性有關(guān)，攜 帶 IL－23 R 基 因 rs10889677、rs1884444、rs11465817多態(tài)性AGC單倍體人群HCC發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增高。但I(xiàn)L－23R基因多態(tài)性在HCC發(fā)病中的確切機(jī)制尚不清楚，有待進(jìn)一步研究闡明。

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