美顏護膚粉劑質(zhì)量標準的研究

李笑芬 謝潔娜 周本宏

（1 武漢大學，湖北 武漢 430072；2 廣州白云山中一藥業(yè)有限公司，廣東 廣州 510140）

美顏護膚粉劑系由多味中藥（大黃、關黃柏、金銀花、生地黃、薄荷等）組成的外用制劑，用于治療顏面痤瘡，有清熱解毒、涼血化瘀、消腫散結等功效。為保證質(zhì)量跟療效，筆者對全部藥味進行了TLC研究，最終采用TLC法對方中主要藥味大黃和關黃柏進行鑒別，采用高效液相色譜（HPLC）法對大黃中的大黃素和大黃酚同時進行定量分析。

1 儀器、試藥與樣品

Agilent 1100 Series HPLC儀，包含G-1313A標準自動進樣器、G-1322A在線真空脫氣機、G-1311A高壓四元梯度泵、G-1315A DAD色譜工作站處理系統(tǒng)（美國Agilent公司）；XP26型電子分析天平（瑞士METTLER公司）；純水儀（美國Millipore公司）；NH1006超聲波清洗機（廣州華南超聲設備有限公司）。

以下對照藥材均為中國藥品生物制品檢定所提供：大黃（批號121249-200402）；關黃柏（批號120937-200506）；黃柏酮（批號111879-201001）；大黃酸（批號110757-200206）；大黃素（批號110756-200110）；大黃酚（批號117096-200716）；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。美顏護膚粉劑（廣州新花城生物科技有限公司，批號11022、11024、11025）。

2 方法與結果

2.1 TLC鑒別

2.1.1 大黃的TLC鑒別[1]

取0.5g本品，20mL甲醇，浸泡1h，過濾，取濾液5mL蒸干，殘渣加10mL水溶解，再加1mL鹽酸，加熱回流30min冷卻，乙醚分2次振搖提取（20mL/次），合并乙醚液蒸干，殘渣加1毫升甲醇溶解作試品溶液；按處方取不含大黃的陰性樣品，同法制陰性對照溶液；另取大黃0.1g同法制對照溶液；取大黃酸對照品，加甲醇制成1mg/mL的溶液作對照品。照TLC法[1]試驗，取上述三種溶液3～5μL，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板，以石油醚（30～60℃）-甲酸乙酯-甲酸（15∶5∶1）的上層溶液為展開劑，展開，取出晾干，紫外光燈（365納米）下檢視。結果：供試品色譜中，對照藥材色譜相應位置，顯相同的4～5個橙黃色熒光斑點；對照品色譜相應位置，顯相同的橙黃色熒光斑點。見圖1。

2.1.2 關黃柏的TLC鑒別[1]

取本品1g，乙酸乙酯10mL，超聲處理20min，過濾，濾液作供試品溶液；取處方量不含關黃柏的陰性樣品，同法制備陰性對照溶液；取關黃柏0.2g，同法制成對照藥材溶液；取黃柏酮，加乙酸乙酯制成0.5mg/mL溶液，作對照品溶液。照TLC法[2]試驗，取上述三種溶液3～5μL，分別點于同一硅膠G薄層板，以石油醚（60～90℃）-乙酸乙酯（1∶1）為展開劑，展開取出，晾干，噴10%硫酸乙醇溶液后105℃加熱至斑點清晰。結果：供試品色譜中，在與對照藥材色譜及對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點；陰性對照無干擾。見圖2。

圖1 大黃TLC

圖2 關黃柏的TLC

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱：KromasiL C18色譜柱（4.6mm×200mm，5μm），流動相：甲醇-0.1%磷酸溶液（85∶15）；波長：254nm；流速：1.0mL/min；柱溫：室溫；進樣量：10μL。

2.2.2 溶液的制備

2.2.2.1 混合對照品溶液的制備

精密稱取適量大黃素、大黃酚對照品，加甲醇溶解制成大黃素濃度為0.0321mg/mL和大黃酚濃度為0.0792mg·/L的混合對照品貯備液，再將其稀釋得到含大黃素和大黃酚濃度為0.01605mg/mL、0.0396mg/mL的混合對照品溶液。

2.2.2.2 供試品溶液的制備[1]

取本品裝量差異項下的內(nèi)容物3g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入25mL甲醇，密塞，稱定重量，超聲處理（功率300W，頻率50kHz）45min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量搖勻，濾過。取續(xù)濾液5mL，置平底燒瓶中揮去甲醇，加10mL 8%鹽酸溶液，超聲處理3min，再加入10mL三氯甲烷，100℃加熱回流提取1h，冷卻，置分漏斗中，用少量三氯甲烷洗滌容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷層，酸液再用三氯甲烷萃取3次，每次10mL，合并三氯甲烷層，揮干三氯甲烷，殘渣加甲醇使溶解，轉移至10mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2.2.3 陰性對照溶液的制備

按處方比例和工藝制備不含大黃的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制得陰性對照溶液。

2.2.3 專屬性試驗

各取10μL對照品、供試品、陰性對照溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進行測定，記錄色譜圖（圖3）。結果表明陰性對照未出現(xiàn)色譜圖，對測定無干擾。

2.2.4 測定波長的選擇

取混合對照品溶液與供試品溶液，采用二極管陣列檢測器（DAD）于190～400nm波長范圍內(nèi)掃描，發(fā)現(xiàn)分別在230nm、254nm處有最大吸收。參考《中國藥典》2010部“大黃”含量測定項條件[1]，采用254nm為檢測波長。

2.2.5 供試品溶液制備方法的確定

超聲45min和回流1h的提取效率相當。超聲法操作簡便快捷，故采用此法；通過對超聲和水解效率及不同的萃取次數(shù)比較，結果顯示超聲處理45min、水解1h、萃取3次可將大黃素及大黃酚提取完全。

2.2.6 精密度試驗

精密吸取10μL混合對照品溶液連續(xù)進樣5次，按2.2.1項下色譜條件進行測定。結果：大黃素峰面積的RSD為0.1%（n=5）；大黃酚峰面積的RSD為0.4%（n=5），表明儀器精密度良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗

精密吸取同一份供試品溶液10μL，分別于0、2、8、16、24h進樣，記錄峰面積，結果：大黃素峰面積和大黃酚峰面積的RSD為分別為0.6%及1.2%，表明供試品溶液在24h內(nèi)基本穩(wěn)定。

圖3 大黃素、大黃酚對照品（A）、美顏護膚粉劑（B）、缺大黃的陰性對照的HPLC圖(C)

2.2.8 重復性試驗

取同一批美顏護膚粉劑6份，分別按“2.2.2”項下的制備方法平行制備6份溶液，依法測定。結果：大黃素平均含量為0.19mg/g，RSD為1.0%（n=5）;大黃酚平均含量為0.43mg/g，RSD為1.2%（n=5）。表明該方法重現(xiàn)性良好。

2.2.9 加樣回收率試驗

精密稱取已知含量的同一供試品約1.5g，分別精密加入含大黃素（濃度0.288mg/mL）及大黃酚（濃度0.635mg/mL）的混合對照品溶液1 mL，按“2.2.2”項下的制備方法制備供試品溶液6份，計算該方法的回收率。結果：大黃素的平均回收率為98.8%，RSD為2.0%；大黃酚的平均回收率為99.0%，RSD為0.8%。

2.2.10 樣品含量測定

取8批樣品，分別按照上述方法制備供試品溶液并測定，計算各樣品中大黃素及大黃酚的含量。結果可見8批樣品每克含大黃以大黃素（C15H10O5）及大黃酚（C15H10O4）總量計，其含量在0.385～0.616mg之間。考慮生產(chǎn)過程中的損耗和藥材質(zhì)量差異等不穩(wěn)定因素，故暫定本品每克含大黃以大黃素（C15H10O5）及大黃酚（C15H10O4）的總量計，不得少于0.30mg。

3 討論

3.1 《中國藥典》2010版一部“大黃”薄層鑒別項要求在紫外燈（365nm）下檢視薄層色譜外，還要求用氨熏顯色后再次檢視薄層色譜。考慮到氨熏操作具強烈的呼吸道刺激性，且顯色后的斑點褪色很快，不利于后續(xù)的圖譜拍攝工作。筆者認為紫外燈（365nm）下檢視得到的薄層圖譜信息已可明確進行大黃鑒別，無需進一步的氨熏顯色操作。

3.2 供試品提取方法的選擇

藥典及一般文獻中均采用加熱回流法提取大黃蒽醌類成分，但經(jīng)筆者試驗發(fā)現(xiàn)，超聲45min已基本將大黃蒽醌類成分提取完全。相對加熱回流法而言，超聲操作更簡便快捷，還可避免因水浴加熱設備可能加熱不均勻?qū)е聹y定結果重復性不佳的問題。