紫龍金片對吉非替尼引起Caco-2細胞通透性增加的抑制作用

王 原 余亮科 房 芳 趙 輝 潘 濤 杜改萍

(河北聯(lián)合大學附屬醫(yī)院消化科，河北 唐山 063000)

吉非替尼(Gefitinib)是一種選擇性表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑，可妨礙腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移和血管生成，并增加腫瘤細胞的凋亡。目前吉非替尼主要用于治療中晚期或轉(zhuǎn)移性非小細胞肺癌(NSCLC)，但有一定的毒副作用，包括胃腸道反應，如惡心、嘔吐及腹瀉等，一定程度上影響患者的生活質(zhì)量〔1〕。有報道稱中藥紫龍金片能在一定程度上減輕化療的副作用〔2〕。本研究擬探討紫龍金片能否通過抑制吉非替尼誘發(fā)的腸道通透性增加而改善胃腸道反應。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 電阻儀ESR-001(密理博，北京);結腸腺癌細胞Caco-2細胞株(購自中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所);胎牛血清(Gibco，美國);Transwell培養(yǎng)板(Cornig，美國);甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體、核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB p65抗體(美國Santa Cruz公司)。

1.2 方法

1.2.1 構建腸上皮細胞屏障模型 Caco-2細胞株培養(yǎng)于含有10%胎牛血清、10 g/L非必需氨基酸、10 g/L谷氨酰胺和青霉素-鏈霉素雙抗液的DMEM完全培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，3 d可基本融合。將Caco-2細胞接種于Transwell板上(孔徑0.8 μm)，接種密度為1×104/cm2，隔日換液，直至形成緊密單層，用于后續(xù)實驗。

1.2.2 制備藥品原液 吉非替尼(250 mg/片)研磨制成粉末，溶于DMEM培養(yǎng)基，配制成250 μg/ml的藥物原液;紫龍金片(0.65 g/片)制成粉末，溶于DMEM培養(yǎng)基配制成650 μg/ml的藥物原液，置于－20℃保存，實驗前用無血清DMEM培養(yǎng)液稀釋成所需濃度。

1.2.3 分組 待Caco-2細胞成緊密單層后，做同步化培養(yǎng)。然后將其分為:正常對照組(組1)、吉非替尼組(組2)和紫龍金片聯(lián)合吉非替尼組(組3)，組2、組3根據(jù)預處理時間又分為12、24 h亞組。各亞組于相應時間點在Transwell基底側(cè)加入吉非替尼(250 μg/ml)、紫龍金片(650 μg/ml)分別孵育 12、24 h。

1.2.4 跨上皮細胞電阻(TEER)的測定 參照文獻〔3，4〕，應用電阻儀測定各組Caco-2細胞的TEER，整個過程在恒定溫度下(37℃)進行，每個Transwell培養(yǎng)環(huán)境下取不同方向的3個點，重復測定3次，取均值乘以培養(yǎng)板膜面積，即為該樣品的TEER值，以Ω·cm2示。

1.2.5 Western印跡檢測NF-κB p65蛋白水平的表達 收集各組細胞，加裂解液冰上裂解，12 000 r/min離心10 min，取上清測定濃度后－80℃保存?zhèn)溆谩Ｊ榛蛩徕c-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離，完畢后將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。5%脫脂奶粉封閉，后放入含一抗的Tris鹽酸緩沖液(TBST)，4℃過夜，洗膜，然后用辣根過氧化物酶標記的二抗室溫反應1 h，目標蛋白質(zhì)用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色。計算機掃描，以GAPDH蛋白做參照，分析處理。

1.3 統(tǒng)計學處理 應用SPSS17.0軟件進行分析，數(shù)據(jù)以±s表示，采用配對t檢驗或單因素方差分析(AVONA)。

2 結果

2.1 各組細胞的TEER 組2、組3各亞組Caco-2細胞TEER值均降低，與組1比較有統(tǒng)計學差異(均P＜0.05)，其中組2 24 h亞組TEER降至最低，與組2、組3其余亞組比較均有統(tǒng)計學意義，組3 24 h亞組TEER值較組3同時間上升明顯(均P＜0.05)。見圖1。

2.2 Western印跡檢測各組細胞NF-κB p65蛋白的表達情況組2、組3的NF-κB p65蛋白表達量升高，與組1比較有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，組3各亞組間NF-κB p65蛋白含量較組2低(P＜0.05)。見圖2。

圖2 不同處理組NF-κB p65蛋白表達變化

3 討論

腸黏膜上皮屏障完善與否是腸道系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)的重要影響因素〔4〕。NF-κB信號轉(zhuǎn)導途徑是細胞內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導通路，在細胞的凋亡、存活、增殖中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)功能，并且參與維持細胞對各種刺激的應答過程〔5〕。

有研究表明，化療和吉非替尼引起的胃腸道反應，一定程度上與腸道上皮細胞通透性增加有關〔6〕。本實驗發(fā)現(xiàn)吉非替尼可損傷Caco-2細胞屏障功能，導致其通透性增加;加用紫龍金片后通透性降低，提示紫龍金片有保護細胞屏障功能的作用。同時還可發(fā)現(xiàn) NF-κB p65蛋白量增加，加用紫龍金片后蛋白表達量減少，推測吉非替尼損傷腸上皮細胞通透性可能與激活NF-κB通路有關，而紫龍金片可能作用于這一通路，以降低細胞間通透性。

圖1 各組不同時間Caco-2細胞通透性變化

1 van Erp NP，Gelderblom H，Guchelaar HJ.Clinical pharmacokinetics of tyrosine kinase inhibitors〔J〕.Cancer Treat Rev，2009;35(8):692-706.

2 汪 江，顏維仁.紫龍金片配合化療治療中晚期非小細胞肺癌的研究〔J〕.現(xiàn)代中西醫(yī)結合雜志，2008;17(1):3-5.

3 王國麗，尹菁華，毛定安，等.TNF-α體外對Caco-2細胞通透性的影響及其機制〔J〕.世界華人消化雜志，2010;18(9):942-6.

4 Schmitz H，F(xiàn)romm M，Bentzel CJ，et al.Tumor necrosis factor-alpha(TNFalpha)regulates the epithelial barrier in the human intestinal cell line HT-29/B6〔J〕.J Cell Sci，1999;112(1):137-46.

5 Pasparakis M.Regulation of tissue homeostasis by NF-kappaB signalling:implications for inflammatory diseases〔J〕.Nat Rev Immunol，2009;9(11):778-88.

6 Melichar B，Dvorák J，Kalábová H，et al.Intestinal permeability，vitamin a absorption and serum alpha-tocopherol during therapy with gefitinib〔J〕.Scand J Clin Lab Invest，2010;70(3):180-7.