清心開竅方皂苷對阿爾茨海默病大鼠學習記憶能力的影響及其機制

朱未名 胡海燕 陳 翔 毛丹丹 葉光華 (溫州鹿城精神病醫院，浙江 溫州 325003)

阿爾茨海默病(AD)發病率隨年齡增長而不斷增加，已成為繼心臟病、腫瘤和腦卒中之后的第四位死亡原因，給家庭和社會帶來很大負擔。中醫對AD的治療有上千年的歷史，積累了豐富的經驗。本文探討清心開竅方皂苷對AD模型大鼠學習記憶能力和海馬區神經膠質細胞原纖維酸性蛋白(GFAP)及Aβ表達的影響。

1 材料與方法

1.1 動物及藥物 SPF級SD大鼠40只，雄性，體重(250±20)g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供〔許可證號:SCXK(湘)2009-0004〕。Aβ25～35由北京博奧森生物技術有限公司生產。清心開竅方由生地、麥冬、白芍、石斛、丹皮、茯神、陳皮、知母、石菖蒲等組成(湖南中醫藥大學附屬第一醫院藥劑科提供)。鹽酸多奈哌齊(安理申)由衛材(中國)藥業有限公司生產(批號:100223A)。

1.2 試劑與儀器 GFAP、Aβ、淀粉樣前體蛋白(APP)、白介素(IL)-1β免疫組化試劑盒、SABC試劑盒、DAB顯色劑由武漢博士德生物工程有限公司提供。BMJ-1生物組織包埋機(天津航空機電公司)。Shandon325型石蠟切片機(英國Shandon公司)。DNP-9162型電熱恒溫培養箱(上海精宏實驗設備有限公司)。LEICA DM LB2型雙目顯微鏡(德國LEICA公司)。Motic B5顯微攝像系統(麥克奧迪實業集團公司)。MIAS醫學圖像分析系統(北航公司)。

1.3 方法

1.3.1 清心開竅方總皂甙成分的提取 清心開竅方經水提醇沉法得到初提藥液，然后采用乙醚、乙酸乙酯、正丁醇等提取分離，得到含70%總皂甙成分的清心開竅方制劑〔1〕。

1.3.2 造模方法 聚集態Aβ25～35的準備:按說明書配置，4℃冰箱保存備用。AD的模型制造參照文獻方法〔2～4〕進行。除正常組外，其余各組均將Aβ25～35注入大鼠雙側杏仁核，通過Aβ的神經毒作用，造成類AD模型。

1.3.3 動物分組及給藥方法 經環境適應性飼養1 w后，于造模前進行水迷宮訓練3 d，剔除差異明顯者。稱體重后按隨機數字表分為7組:正常組、模型組、清心開竅方組(清開組)、皂苷組及安理申組，每組8只。依標準動物體質量法，清心開竅方組、皂苷組及安理申給藥分別相當于60 kg成人用藥的20倍。于造模后第2天灌胃，每天1次，其余各組用等量的雙蒸水灌胃，連續2 w，水迷宮測試期間，于測試前30 min給藥。

1.3.4 行為學檢測方法 采用Morris水迷宮法。全部給藥結束后開始水迷宮測試，在水池中注入清水，水面高出平臺2 cm，水溫控制在(21±1.5)℃。平臺置于某一象限中間，在其他3個象限中任選一入水點，將大鼠面向池壁放入水中，觀察并記錄大鼠在水中游泳尋找并爬上平臺的路線圖、所需的時間(即潛伏期)，潛伏期的時間長短作為學習記憶能力的指標。設定最長游動時限為60 s，如果大鼠在60 s內未找到平臺，需將其引至平臺并停留10 s以強化記憶，這時所需時間記為60 s。每天訓練2次，連續5 d。第6天撤除平臺，記錄大鼠在1 min內跨越平臺相應位置的次數，作為空間探索能力的指標。

1.3.5 標本制備方法 第15天處死動物，冰臺上迅速取出腦組織，分離海馬，放入4%多聚甲醛固定液中固定，將固定好的大腦組織取出，室溫下經梯度酒精脫水(70%A→80%A→95%AⅠ→95%AⅡ→100%AⅠ→100%AⅡ)，二甲苯透明，浸蠟，石蠟包埋，備用。

1.3.6 免疫組織化學檢測方法 石蠟切片厚5 μm，裱于用APES處理過的載玻片上，置45℃溫箱內烤片24 h。切片常規脫蠟至水。滴加 3% H2O2室溫孵育 10 min，蒸餾水洗2 min/次×3。熱修復抗原10 min，PBS洗2 min/次×3。滴加正常山羊血清封閉液，室溫孵育10 min，甩去多余血清。滴加特異性抗體，置濕盒內4℃冰箱過夜，PBS洗3 min/次×3。滴加生物素化 IgG，置濕盒內37℃溫箱內孵育20 min，PBS洗3 min/次×3。滴加鏈霉親和素-過氧化物酶，置濕盒內37℃溫箱內孵育20 min，PBS洗3 min/次 ×3。DAB 顯色5～10 min，蒸餾水洗。蘇木素輕度復染，蒸餾水洗。常規脫水、二甲苯透明、樹脂膠封固，顯微鏡觀察。采用圖像分析系統，每組選取6張切片，每張切片隨機觀察5個視野，精確選取視野內所有陽性顆粒，計算機自動算出面密度。面密度就是陽性目標總面積和統計場總面積之比，用于定量表達免疫組化陽性反應程度。

1.4 統計學方法 采用SPSS16.0統計軟件處理，實驗數據以±s表示，多個樣本均數比較采用單因素方差分析，組間方差分析用F檢驗，有差異的組間兩兩比較用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠學習記憶能力和空間探索能力比較 各組大鼠潛伏期第1天、第2天無顯著性差異(P＞0.05)，隨著訓練天數的增加各組大鼠潛伏期均縮短，模型組與正常組相比潛伏期明顯延長，且第6天跨越平臺的次數減少(P＜0.01);模型組與清開方組和安理申組相比有極顯著性差異(P＜0.01);與皂苷組相比，差異亦有顯著性(P＜0.05)。見表1。

表1 各組大鼠潛伏期比較(±s，s，n=8)

表1 各組大鼠潛伏期比較(±s，s，n=8)

與模型組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01;下表同

組別 第1天 第2天 第3天 第4天 第5天 第6天正常組 52.52±12.02 45.39±10.40 21.28±10.992) 17.87±7.112) 15.16±9.022) 3.88±0.782)模型組 56.97±10.69 49.77±7.11 49.47±11.54 46.26±9.25 43.46±11.68 0.55±0.52清開方組 56.86±9.43 47.42±9.07 23.19±15.942) 21.39±6.792) 19.13±11.422) 2.80±1.612)安理申組 56.83±8.99 47.11±9.11 22.77±7.932) 19.24±12.522) 17.78±11.542) 2.90±1.192)皂苷組 55.76±9.50 48.06±6.93 35.55±10.841) 32.35±12.251) 29.82±12.511) 1.88±1.451)

2.2 大鼠大腦海馬區GFAP及IL-1β表達水平比較 模型組與正常組相比，大鼠海馬區GFAP表達明顯增多(P＜0.01);清開方組、皂苷組與模型組相比，海馬區GFAP表達均減少(P＜0.05);安理申組與模型組相比，海馬區GFAP表達減少(P＜0.01)。海馬區IL-1β表達清開方組與模型組比較明顯降低，(P＜0.05)，與皂苷組比較無顯著差異(P＞0.05)。見表2、圖1、圖 2。

2.3 大鼠海馬區Aβ、APP表達水平比較 大鼠模型組與正常組相比，海馬Aβ、APP表達均明顯增多(P＜0.01);清開方組與模型組相比，海馬Aβ、APP表達均明顯減少(P＜0.01，P＜0.05);皂苷組與模型組相比，海馬 Aβ、APP表達減少(P＜0.05)。見表3、圖3、圖4。

圖1 各組大鼠海馬區GFAP表達(SABC法，×400)

圖2 各組大鼠海馬區IL-1β表達(SABC法，×400)

圖3 各組大鼠海馬區Aβ表達(SABC法，×400)

表2 大鼠海馬區GFAP、IL-1β表達水平比較(±s，n=6)

表2 大鼠海馬區GFAP、IL-1β表達水平比較(±s，n=6)

面密度正常組 0.045 2±0.006 82) 0.057 8±0.002 12)組別 GFAP面密度 IL-1β模型組 0.086 3±0.011 6 0.110 6±0.009 4安理申組 0.047 4±0.004 52) 0.093 8±0.005 21)清開方組 0.068 5±0.007 71) 0.094 1±0.007 51)皂苷組 0.071 7±0.013 01)0.104 1±0.011 1

表3 大鼠海馬區Aβ、APP表達水平比較(±s，n=6)

表3 大鼠海馬區Aβ、APP表達水平比較(±s，n=6)

面密度正常組 0.038 3±0.001 72) 0.036 6±0.008 82)組別 Aβ面密度 APP模型組 0.080 0±0.010 1 0.085 7±0.012 1安理申組 0.068 4±0.003 51) 0.042 8±0.012 02)清開方組 0.042 1±0.004 62) 0.073 2±0.008 51)皂苷組 0.069 2±0.002 41) 0.074 5±0.005 31)

圖4 各組大鼠海馬區βAPP表達(SABC法，×400)

3 討論

Aβ在腦內沉積是AD早期的主要病理變化〔5，6〕。Aβ來源于體內APP，含有KPI結構的APP可能通過抑制Aβ的降解增加局部Aβ的濃度。SP中除含有淀粉樣蛋白外，還包括炎性細胞因子IL-1、IL-6等，提示慢性炎癥和免疫反應參與了AD的病理過程。Aβ通過激活小膠質細胞，將急性反應轉變成慢性炎癥損傷，其機制可能是小膠質細胞膜上的受體復合物(CD36和CD47)與神經元周圍沉積的Aβ發生相互作用，導致小膠質細胞活化、增殖，GFAP是星形膠質細胞的標志物。AD患者大腦中GFAP水平可提高8～16倍，在中樞神經系統受損傷時，星形膠質細胞轉化為反應性星形細胞致體積增大，出現GFAP增多的特征，而過量分泌促炎因子，介導炎癥損傷〔7〕。有研究表明IL-1β過度表達和釋放是其始動環節，IL-1β可以上調小膠質細胞和星形膠質細胞表達促炎因子，誘導補體、氧自由基、NO、β-APP等生成增加，導致慢性炎癥的形成和炎性產物的大量產生，各種高水平的炎性產物在AD病理損傷中產生不同的病理促進作用，并貫穿AD病理發展的整個過程〔8〕。

本實驗所采用方藥源自明代著名醫學家張景岳《景岳全書》中的“蠻煎”，由生地、麥冬、芍藥、石菖蒲、石斛、牡丹皮、茯神、陳皮、知母、去木通，加苦參而成，具有清心涼血開竅功效。課題組自2004年開始通過動物試驗來闡釋清心開竅方治療AD的療效與機制，結果顯示，清心開竅方水煎劑能明顯改善由AlCl3灌胃導致癡呆的AD小鼠學習記憶能力，降低AD小鼠腦組織中NO、NOS含量及Ache活性，降低氧自由基對機體的損傷，明顯改善海馬神經細胞的破壞〔9～12〕。

本研究在以往研究的基礎上采用Aβ25～35雙側杏仁核注射法，通過Aβ的毒性作用制作AD大鼠模型，以清心開竅方及其總皂苷進行治療，結果顯示清心開竅方通過降低GFAP，減輕炎性反應，調節Aβ及βAPP代謝而改善AD大鼠學習記憶的能力，提示通過有效抑制腦內炎性反應，減少Aβ產生是清心開竅方治療AD的重要機制之一。由于課題經費和時間所限，本研究中動物實驗的標本數量不夠多，觀察周期比較短，而有關清心開竅方在改善鈣代謝、抑制細胞凋亡以及提高神經營養因子保護作用等方面的研究沒有進行具體分析，還有待下一步深入探討。

1 陳 奇.中藥藥理研究方法學〔M〕.北京:人民衛生出版社，1993:69-71.

2 Sofroniew MV，Pearson RC.Degeneration of cholinergic neurons in the basal nucleus following kainic or N-methy-D-aspartic acid application to the cerebral cortex in the ra〔tJ〕.Brain Res，1985;339(1):186-90.

3 Miyamoto M，Shintani M，Nagaoka A，et al.Lesioning of the rat basal forebrain leads to memory impairments in passive and active avoidance tasks〔J〕.Brain Res，1985;328(1):97-104.

4 Frautschy SA，Yang F，Calderon L，et al.Rodent models of Alzheimer's disease:rat A beta infusion approaches to amyloid deposits〔J〕.Neurobiol Aging，1996;17(2):311-21.

5 Malin DH，Crothers MK，Lake JR，et al.Hippocampal injections of amyloid β-Peptide 1-40 impair subsequent one-trial/day reward learning〔J〕.Neurobiol Learn Mem，2001;76(2):125-7.

6 Moir RD，Tanzi RE.LRP-mediated clearance of Abeta is inhibited by KPI-containing is form of APP〔J〕.Curr Alzheimer Res，2005;2(2):276-80.

7 Bamberger ME，Harris ME，McDonald DR，et al.A cell surface receptor complex for fibrillar beta-amyloid mediates microglial activation〔J〕.J Neurosci，2003;23(7):2665-8.

8 Li Y，Liu L，Barger SW.Interleukin-1 mediates pathological effects of microglia on tau phosphorylation and on synaptophysin synthesis in cortical neurons through a p38-MAPK pathway〔J〕.J Neurosci，2003;23(5):1605-7.

9 胡海燕，米金霞，朱未名，等.清心開竅方對老年癡呆模型大鼠學習記憶能力的影響研究〔J〕，浙江中醫雜志，2008;43(2):104-6.

10 胡海燕，朱 偉，黃 麗，等.清心開竅方對阿爾茨海默病模型小鼠學習記憶能力及腦組織自由基代謝的影響〔J〕.中國老年學雜志，2007;27(20):1961-3.

11 胡海燕，朱未名.清心開竅方對AD小鼠腦組織NO、AchE含量及海馬CA1區神經細胞形態學改變的實驗研究〔J〕.福建中醫藥，2007;38(1):40-1，44.

12 胡海燕，孟 瓊，蔣 哲，等.清心開竅方對AD小鼠學習記憶能力及海馬CA1區神經細胞形態的影響〔J〕，中國中藥雜志，2008;33(10):1184-7.