雞眼草總黃酮的提取工藝條件及其體外抗氧化性

王春景 胡小梅 劉高峰 李 晶 (蚌埠醫學院生物科學系，安徽 蚌埠 233000)

雞眼草蝶形花科雞眼草屬的一年生草本植物，俗稱掐不齊、人字草等，生于路邊、林下、田野、山地、丘陵。雞眼草具有抗炎鎮痛〔1，2〕、止血〔3〕等生物活性，用于治療嬰幼兒遷延性慢性腹瀉療效顯著〔4〕，對 IgA腎病模型大鼠具有一定的治療作用〔5〕，雞眼草也是國內苗醫用于骨傷疾病的苗族藥物之一〔6〕。雞眼草含有芹菜素、槲皮素、芹菜素－7－O－β－D－葡萄糖苷、山萘酚－7－O－β－D－葡萄糖苷、芹菜素－7－O－新橙皮糖苷等黃酮類化合物〔7〕，雞眼草黃酮類化合物具有抑制白細胞介素－5的生物活性〔8〕。已有研究表明很多植物黃酮類化合物具有較強的清除自由基等抗氧化作用〔9～11〕，關于雞眼草總黃酮的提取工藝研究及其抗氧化活性研究均未見具體報道，本文研究了雞眼草總黃酮的提取工藝條件及其體外抗氧化活性，以期為雞眼草黃酮類化合物的進一步開發利用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 蘆丁:南京替斯艾么中藥研究所;鄰苯三酚Amersco公司分裝;Tris Feinbiochemica Heidelberg公司;抗超氧陰離子自由基及產生超氧陰離子自由基測試盒、總抗氧化能力(T－AOC)測定試劑盒:南京建成生物工程研究所;乙醇、石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、NaOH、NaNO2、Al(NO3)3、水楊酸、H2O2、FeSO4、鹽酸等均為國產分析純。實驗材料雞眼草九月中旬采于蚌埠市郊區。UV－1800紫外/可見分光光度計:北京瑞利分析儀器公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 總黃酮的提取工藝

1.2.1.1 提取方法 雞眼草65℃烘至恒重后粉碎，乙醇浸提，蒸干所得浸膏用溫蒸餾水混懸，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，合并乙酸乙酯和正丁醇萃取部，蒸干得雞眼草粗黃酮粉。

1.2.1.2 總黃酮含量的測定〔12〕精密稱取蘆丁0.01 g，用體積分數 30%的乙醇溶解并定容至 100 ml，配成濃度為0.1 mg/ml的蘆丁標準液，吸取蘆丁標準液 0、1、2、3、4、5、6、7、8 ml于9支刻度試管中，分別加0.3 ml 5%NaNO2，搖勻，靜置6 min;再加10%Al(NO3)30.3 ml，搖勻，靜置6 min;再加入 4%NaOH 4 ml，用 30% 乙醇定容至 10 ml，搖勻，靜置 15 min，以 0濃度為參比，波長510 nm測吸光度，將蘆丁濃度與吸光度進行線性回歸得標準曲線:A=15.617c－0.004 1，R2=0.999 8。樣品中的黃酮含量測定方法為:將所得粗黃酮粉用適量30%乙醇溶解后，取1 ml，按上述標準曲線制作的方法測定吸光度，再由標準曲線計算出黃酮濃度。

1.2.1.3 單因素實驗 選取溫度、乙醇濃度、料液比和時間4個因素分別做單因素實驗，考察它們對總黃酮得率的影響。具體為:分別稱取雞眼草粉末1 g，按料液比1∶30、65%的乙醇、提取3.0 h，考察不同提取溫度(55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃)對其總黃酮得率的影響;以料液比 1∶30、65℃、提取3.0 h，考察不同乙醇濃度(50%、55%、60%、65%、70%、75%)對其總黃酮得率的影響;按65℃、65%的乙醇、提取3.0 h，考察不同料液比(1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45、1∶50、1∶55)對其總黃酮得率的影響;以料液比1∶30、65℃、65%的乙醇，考察不同提取時間(2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 h)對其總黃酮得率的影響。

1.2.1.4 正交試驗設計 在以上單因素實驗的基礎上，每因素選取3個水平，設計L9(34)正交試驗，從而確定最佳提取工藝條件，各因素水平設計見表1。

表1 正交試驗因素水平設計

1.2.2 抗氧化活性測定

1.2.2.1 羥自由基(·OH)清除實驗〔13〕水楊酸法，向反應體系中分別加入6 mmol/L FeSO4溶液2 ml、6 mmol/L水楊酸－乙醇溶液 2 ml、濃度為 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mg/ml的黃酮液 2 ml，搖勻，再各加入 6 mmol/L H2O22 ml，用蒸餾水定容至10 ml，搖勻，37℃水浴30 min，以蒸餾水為參比，510 nm測定各吸光度Am，同樣方法測定不加黃酮液的吸光度A0，不加H2O2各黃酮液的本底吸光度An。

1.2.2.3 抗超氧陰離子自由基(?)活力實驗 按照測定試劑盒的操作方法進行實驗，抗?活力單位定義為:在反應體系中，每毫升黃酮液在37℃反應40 min所抑制的相當于1 mg的維生素C所抑制的的變化值為一個活力單位。

1.2.2.4 總抗氧化能力(T－AOC)測定 按照測定試劑盒的操作方法進行實驗，T－AOC單位定義為:在37℃時，每分鐘每毫升黃酮液使反應體系的吸光度值每增加0.01時，為一個總抗氧化能力單位。

1.3 統計學方法 采用方差分析進行組間比較。

2 結果

2.1 單因素實驗結果 由圖1可知，隨著溫度升高，總黃酮得率隨之提高，75℃時又有所降低，故選擇60℃、65℃、70℃作為正交試驗溫度的優化水平。由圖2可看出，乙醇濃度為55%時總黃酮得率最高，隨著乙醇濃度的增加，總黃酮得率又有所下降，并趨于平穩，故選擇55%、60%、65%作為進一步提取優化的條件。由圖3可知，提取時間為2.5 h和3.0 h時，總黃酮得率基本無變化，隨著提取時間的進一步延長，總黃酮得率呈下降趨勢，故選擇2.5 h、3.0 h、3.5 h作為進一步提取優化選擇的條件。圖4表明，隨著料液比的增加，總黃酮得率亦隨之增加，特別是1∶40～1∶50時增加較快，隨后又趨于平穩，故選擇1∶40、1∶45、1∶50作為正交試驗料液比的進一步優化水平。

2.2 正交試驗結果與分析 正交試驗結果表明(表2)，提取溫度、乙醇濃度、提取時間、料液比4因素對雞眼草總黃酮得率的影響為大小為:料液比＞提取溫度＞提取時間＞乙醇濃度(即D＞A＞C＞B)，最佳提取工藝條件為:A3B1C1D3，即提取溫度為70℃、乙醇濃度為55%、提取時間為2.5 h、料液比為1∶50時，雞眼草總黃酮的提取得率最高。進一步方差分析表明(表3)，試驗選取的4因素的3個水平，提取溫度、乙醇濃度和提取時間這3因素的3個水平對雞眼草總黃酮得率的影響差異不顯著(P＞0.05)，料液比的3水平間差異顯著(P＜0.05)。通過各因素的F值看出FD＞FA＞FC＞FB，這與表2直觀得出的4因素影響大小(D＞A＞C＞B)結果是一致的。

表2的正交試驗設計中不包括最佳提取工藝條件A3B1C1D3，需追加實驗進行驗證。將5份雞眼草粉末按提取溫度為70℃、55%乙醇、料液比為1∶50、提取2.5 h，計算總黃酮得率為(2.10±0.95)%。在A3B1C1D3條件下，雞眼草總黃酮得率高于表2設計的各組合，所以按A3B1C1D3條件提取雞眼草總黃酮，得率較高，且實驗穩定性也較強。

表2 正交試驗設計及結果

表3 正交實驗結果方差分析

2.3 體外抗氧化性結果

2.3.1 對·OH的清除作用 由圖5可看出，隨著雞眼草總黃酮濃度的升高，·OH的清除率逐漸增加，且其濃度與清除率之間存在一定的量效關系。將濃度與清除率進行線性回歸，利用回歸方程求出當清除率為50%時的濃度，即其半數清除濃度(EC50)為 3.17 mg/ml。

2.3.4 總抗氧化能力 隨著雞眼草總黃酮濃度的增加，其總抗氧化能力單位亦隨之增大 (見圖6)，表明其總抗氧化能力逐漸增強，這可能與其能夠清除·OH和 等自由基是相關的。觀察〔J〕. 現代中西醫結合雜志，2010;19(5):553－4.

圖1 提取溫度對雞眼草黃酮得率的影響

圖2 乙醇濃度對雞眼草黃酮得率的影響

圖3 提取時間對雞眼草黃酮得率的影響

圖4 料液比對雞眼草黃酮得率的影響

圖5 雞眼草總黃酮對·OH和的清除效果

圖6 雞眼草總黃酮抗活力和總抗氧化能力

3 討論

單因素實驗及正交試驗結果表明，提取溫度、乙醇濃度、提取時間、料液比4因素對雞眼草總黃酮得率的影響為大小為:料液比＞提取溫度＞提取時間＞乙醇濃度，最佳提取工藝條件為:提取溫度為70℃、乙醇濃度為55%、提取時間為2.5 h、料液比為1∶50，按此工藝條件提取，雞眼草總黃酮的提取得率約為2.10%。該提取工藝條件簡單易行，且重現性較好。雞眼草總黃酮對羥自由基和超氧陰離子自由基均具有一定的清除作用，其清除率與濃度間存在一定的量效關系。雞眼草總黃酮抗超氧陰離子自由基活力單位和總抗氧化能力單位亦隨著其濃度的增加而增加，均表明雞眼草總黃酮具有一定的體外抗氧化活性，可考慮將其黃酮類化合物開發為抗氧化保健食品或生物制品，從而促進雞眼草的進一步開發利用。

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