臍血間充質干細胞移植對阿爾茨海默病大鼠行為學的影響

王麗娟 (赤峰學院醫學院，內蒙古 赤峰 024000)

阿爾茨海默病(AD)臨床癥狀的特征是記憶和其他認知功能顯著減退，導致患者無法正常思考和判斷，必須由他人照料生活。隨著人類平均壽命延長和人口老齡化的出現，AD對人類健康的危害變得日益突出，是威脅老年人生命健康的高發病。但由于各種技術上的原因，AD的治療尚未取得突破性進展。成體干細胞的多潛能性為AD的治療提供了新的思路和方法〔1〕。本實驗主要觀察定向誘導前后的人臍血間充質干細胞(hUCB－MSCs)海馬移植對AD模型大鼠行為學的影響，旨在尋找出最佳治療方案，為AD的治療提供新的方法。

1 材料與方法

1.1 動物與材料 健康雄性Wistar大鼠40只，鼠齡6個月，質量 (400±20)g，購自大連醫科大學實驗動物中心。新鮮臍血由大連醫科大學附屬第一醫院婦產科提供。在征得產婦同意后，無菌條件下采集新生兒臍血，用肝素抗凝。IMDM培養基購自Gibco公司，β－巰基乙醇、纖維結合素購自美國Sigma公司，抗ChAT抗體購自CHEMICON公司，腦立體定位儀購自日本光電公司，MG－2型迷宮購自張家港市生物儀器廠，氫溴酸東莨菪堿注射液購自上海禾豐制藥有限公司，規格1 ml∶0.3 mg，D－半乳糖購自Amresco公司，用時2.5 g溶于250 ml生理鹽水中。氯化鋁購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 動物模型的制備 選用Wistar大鼠依據文獻〔2，3〕建立動物模型。方法如下:動物采用普通飼料適應性喂養1 w以后，大鼠每日D－半乳糖腹腔注射50mg/kg及20 mg/ml AlCl3，2 ml，每日1次，連續6 w，同時在普通飼料的基礎上，按體重8%的進食量添加AlCl3·6H2O，劑量111.9 mg/kg體重，喂飼90 d，采用Y－電迷宮儀訓練和測定大鼠學習記憶能力。在行為學實驗前10 min，一次性腹腔注射氫溴酸東莨菪堿2 mg/kg，讓大鼠在迷路箱內適應3 min，順時針給予燈光刺激(燈光區為安全區，其余為刺激區)，待其逃避至安全區，燈光繼續作用15 s，然后停燈休息1 min，再給予第2次刺激，依次重復40次，大鼠在10 s內從刺激區一次性跑向安全區即被判為正確，否則均判為錯誤.記錄正確與錯誤的次數。滿分為100分，每出錯1次2.5分。學習48 h后進行記憶測試，方法同上。學習、記憶成績均在50分以下者為成功模型大鼠。40只大鼠采用隨機數字表法分為對照組、hUCB－MSCs移植組、常氧分化移植組和低氧分化移植組，每組10只。

1.3 人hUCB－MSCs的培養及向神經元樣細胞定向誘導分化依據文獻〔4〕培養人 hUCB－MSCs，待細胞匯合約達70%時，用0.25%胰蛋白酶消化，按2.0×106/皿密度接種于涂有纖維結合素的35 mm培養皿中，隨機分3組，即hUCB－MSCs組、常氧分化組和低氧分化組，每組6皿。臍血MSCs組、常氧分化組細胞置于CO2培養箱常氧培養;低氧分化組細胞在體積分數為3%O2的環境中培養。分化組于接種24 h后棄去培養液，用解剖液洗2次，加入預誘導液(IMDM+20%胎牛血清+1%L谷氨酰胺+1%雙抗+終濃度1 mmol/L BME);預誘導24 h后棄去預誘導液，用解剖液洗2次，再加入誘導液(IMDM+1%L谷氨酰胺+1%N2+1%雙抗+終濃度5 mmol/LBME)誘導5 h。誘導結束后，將3組細胞同時固定，然后進行細胞免疫化學法鑒定。按2×106個/瓶密度接種于涂有纖維結合素的75 cm2培養瓶中，分組及分化方法同上，每組5瓶，用于細胞移植。

1.4 細胞移植 常規胰酶消化各組hUCB－MSCs，并用含胎牛血清的培養液終止，制成單細胞懸液，采用血球計數板計數法在顯微鏡下(×100)進行計數，調整活細胞濃度為5×1011L－1備用。AD模型大鼠經3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)腹腔麻醉后，固定于腦立體定位儀上，頭部備皮，體積分數為75%乙醇消毒手術區皮膚，無菌操作，切開皮膚，鈍性分離，參照《大鼠腦立體定位圖譜》，選取雙側海馬為移植區，進行移植。一側移植用細胞量為 4 μl(2 ×105個細胞)，注射速度為 1 μl/min，留針5 min。在對照組大鼠海馬腦區注入等量的生理鹽水。局部消毒，縫合皮膚。

1.5 主要觀察指標 分別在細胞移植前1 d和手術后8 w測定各組動物行為學，以學習、記憶成績為客觀觀測指標。

1.6 統計學分析 采用SPSS19.0軟件包進行統計處理，實驗數據以±s表示，多樣本均數比較采用方差分析。

2 結果

2.1 人hUCB－MSCs定向誘導分化為ChAT陽性神經元鏡下觀察 hUCB－MSCs組細胞形態無明顯改變(圖1);分化組hUCBMSCs經誘導可向神經元樣細胞方向分化(圖2)，低氧分化組hUCB－MSCs轉變為神經元樣形態的明顯多于常氧分化組。細胞鑒定:結果顯示，hUCB－MSCs組未見ChAT陽性神經元;分化組可見ChAT陽性神經元。通過計數得出:常氧分化組ChAT陽性神經元約占細胞總數的(6.8±0.3)%;低氧分化組ChAT陽性神經元約占細胞總數的(21.2±4.6)%，兩組相比，差異具有非常顯著性意義(P＜0.01)。

2.2 細胞移植后各組大鼠的行為學改變 由表1可知，對照組AD大鼠術后學習記憶成績均下降，與術前相比，差異無顯著性意義(P＞0.05);hUCB－MSCs移植組大鼠學習記憶成績均提高，與移植前相比，差異無顯著性意義(P＞0.05);常氧分化移植組和低氧分化移植組大鼠學習記憶成績均提高，后者大鼠學習記憶成績均高于前者，兩者與移植前相比，差異均有顯著性意義(P＜0.01);與對照組相比，其他3組大鼠學習記憶成績均提高(P＜0.01)。

圖1 人hUCB-MSCs(×400)

圖2 神經元樣細胞(×400)

表1 各組大鼠hUCB-MSCs移植前后學習記憶成績變化(±s，n=10)

表1 各組大鼠hUCB-MSCs移植前后學習記憶成績變化(±s，n=10)

與對照組比較:1)P＜0.01;與移植前比較:2)P＜0.01

組別 移植前學習分數 記憶分數移植8 w后學習分數 記憶分數對照組 40.00±2.04 40.25±2.19 39.00±1.75 39.75±2.19 MSC移植組 40.25±2.99 44.00±2.42 42.50±1.671)45.75±2.371)常氧分化移植組 39.75±2.99 40.25±2.99 45.75±2.901)2)46.00±3.161)2)低氧分化移植組 38.25±2.37 39.75±2.99 52.50±2.041)2)53.00±3.071)2)

3 討論

AD的病因尚不清楚、發病機制非常復雜〔5～10〕，鋁是一種神經毒素，易沉積于腦內而對中樞神經系統具有毒性作用，到目前為止，鋁對學習記憶的抑制作用已在多數動物和人身上得到證實〔11〕。國外有學者報道鋁作業工人的短期記憶能力、學習能力、視空間感知能力、心理運動能力均受到一定程度的損害。也有調查顯示鋁廠附近的兒童其智力要明顯低于同年齡的其他兒童。動物實驗發現，給貓、家兔、大鼠和小鼠等染鋁，均可引起一系列行為異常，而且動物出現認知和記憶障礙的時間也早于其他指標〔6〕。D－半乳糖可致大鼠亞急性衰老，氫溴酸東莨菪堿是中樞膽堿能抑制劑，引起膽堿能系統功能障礙。因此復合型AD大鼠模型 (集衰老、膽堿能損害、鋁中毒為一體的AD模型)可以更好的模擬出AD患者的病理生理及行為學表現〔12〕。本實驗制作大鼠模型適合于治療方法的篩選和療效評價，可為臨床應用hUCB－MSCs治療AD提供實驗數據，具有較強的實用性和應用性。

用于神經移植理想的細胞來源應具備:①移植的細胞在體外可大量繁殖和擴增。②安全可靠。③移植細胞能夠分化為神經元和神經膠質細胞。④不需要長時期使用免疫抑制劑。間充質干細胞具備這些特性，決定了它可以作為移植治療AD的理想細胞來源。

除此之外，間充質干細胞還具備以下優勢:①取材方便，細胞來源比較充足。除臍血外，骨髓、臍帶等組織也存在間充質干細胞。②在一定培養條件下，可在短時間內大量擴增。③易被穩定轉染以及作為基因載體能長期表達外源性基因。④能透過血腦屏障，通過靜脈內移植。⑤避免了倫理道德上的爭議。⑥具有免疫耐受性或免疫無反應性。胚胎干細胞和神經干細胞已用于治療神經系統疾病〔13，14〕，但無法在臨床上推廣應用，由于存在難以克服的困難，主要限制因素是存在倫理道德問題和取材非常困難，所以，尋找新的細胞來源成為細胞治療首要解決的問題。最近，已有應用骨髓間充質干細胞治療AD的報到〔15，16〕，但骨髓間充質干細胞實驗僅限于自體移植方面，在異體移植免疫反應問題上有待進一步探索。而 hUCB－MSCs免疫源性相對較低，可以從冷凍保存長達0.5～5年的臍血中培養成功，這意味著臍血MSC有著其他來源的MSC所不具備的優勢，將成為神經系統疾病移植治療理想的種子細胞，有著廣泛的臨床應用前景。

hUCB－MSCs作為有潛力的治療手段來預防各種不同的神經組織退化病包括AD正在研究〔17〕，Lee等〔18〕在體外進行了在二乙基溴乙酰胺消失過程中培養β淀粉樣蛋白治療的海馬趾神經元聚集體來研究hUCB－MSCs治療潛能。證實了hUCBMSCs共培養通過β淀粉樣蛋白治療減少了海馬趾的凋亡效應。而且，在一個嚴重的AD鼠模型中在AD相關的認知能力和神經病理學結果方面來直接實驗hUCB－MSCs的治療效能，證明了神經膠質活化的標志、氧化應激和凋亡水平在AD鼠腦中都減少了。有趣的是，hUCB－MSCs治療了AD鼠，證明挽救了包括學習功能的恢復的認知能力。本實驗的結果提示hUCB－MSCs移植對癡呆大鼠的認知功能障礙有一定的治療作用，且定向誘導分化的hUCB－MSCs移植治療優于未分化的hUCB－MSCs，低氧誘導分化的 hUCB－MSCs移植治療效果最佳。hUCB－MSCs的治療作用究竟是通過何種機制得以實現，將在以后的研究中進一步明確。

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