二十烷酸對(duì)大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元Aβ生成的影響及激活過(guò)氧化物酶體增殖劑激活受體α的干預(yù)作用

石如玲 張 煜 姜玲玲 石 蕓 (新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，河南 新鄉(xiāng) 453003)

阿爾茨海默病(AD)發(fā)生與腦內(nèi)飽和脂肪酸增多有關(guān)。但是飽和脂肪酸在AD發(fā)病機(jī)制中起何作用，目前尚不清楚。β－淀粉樣蛋白(Aβ)通過(guò)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)最終導(dǎo)致AD特征性病理改變及腦功能障礙。軟脂酸可誘導(dǎo)神經(jīng)元的 β－分泌酶(BACE1)蛋白表達(dá)升高〔1〕，但目前關(guān)于飽和脂肪酸與Aβ生成的研究報(bào)道還很少見(jiàn)，飽和脂肪酸如何影響Aβ的生成還需要進(jìn)一步研究闡明。過(guò)氧化物酶體增殖劑激活受體α(PPARα)是調(diào)節(jié)脂肪酸分解代謝的重要因子〔2〕，激活PPARα促進(jìn)脂肪酸分解是否會(huì)影響到脂肪酸對(duì)Aβ生成的作用，目前也未見(jiàn)報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)以原代培養(yǎng)的大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元為研究對(duì)象，觀察二十烷酸(EA)對(duì)神經(jīng)元Aβ生成途徑的影響以及激活PPARα的干預(yù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 新生SD大鼠(出生24 h內(nèi))由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料及試劑 EA購(gòu)自Alltech公司;Wy14，643購(gòu)自Cayman公司Aβ40 ELISA試劑盒購(gòu)自Biosource公司;Neurobasal培養(yǎng)基、B27、L－谷氨酰胺購(gòu)自 Gibco公司;DMEM、標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清購(gòu)自Hyclone公司;抗APP、BACE1一抗購(gòu)自Abcam公司，二抗購(gòu)自Zymed公司，化學(xué)發(fā)光試劑購(gòu)自Santa Cruz公司;TRIzol試劑購(gòu)自Invitrogen公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Taq DNA聚合酶購(gòu)自Fermentas公司。

1.3 大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元的原代培養(yǎng) 取24 h內(nèi)新生SD大鼠5～6只，75%乙醇消毒，無(wú)菌條件下分離大腦皮質(zhì)置于預(yù)冷DMEM中，將皮質(zhì)剪成1 mm3小塊，加入0.125%胰酶，37℃消化25 min，加入等體積種植液(含90%DMEM+10%標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清+100 U/ml青、鏈霉素)終止消化。棄上清，加入種植液，吹打制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為0.5×106/ml，接種于6孔培養(yǎng)板中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，去除種植液，改加B27無(wú)血清培養(yǎng)液(含98%Neurobasal+2%B27+0.5 mmol/L－谷氨酰胺+100 U/ml青、鏈霉素)。以后每3天換液1次，每次更換一半新鮮B27無(wú)血清培養(yǎng)液。培養(yǎng)至第7天后用于實(shí)驗(yàn)。應(yīng)用抗微管相關(guān)蛋白－2抗體進(jìn)行神經(jīng)元純度鑒定，結(jié)果表明神經(jīng)元純度在90%以上。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組 將神經(jīng)元隨機(jī)分為3組，對(duì)照組、EA組、EA+Wy14 643組(EA+Wy組)。EA組培養(yǎng)液含40 μmol/L EA;EA+Wy 組 培 養(yǎng) 液 含 40 μmol/L EA 和 10 μmol/L Wy14 643;對(duì)照組培養(yǎng)液含等量溶劑。EA貯存液(5 mmol/L)用10%BSA配置，Wy14 643貯存液(60 mmol/L)用DMSO配置。選用的藥物濃度下各組神經(jīng)元生長(zhǎng)正常，形態(tài)上無(wú)差異。給藥后繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.5 ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中Aβ含量 藥物作用24 h后，收集培養(yǎng)液，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)，用雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)液中Aβ含量。酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm光密度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各樣本Aβ含量。

1.6 Western印跡法檢測(cè)神經(jīng)元APP、BACE1蛋白表達(dá) 藥物作用24 h后，去除培養(yǎng)液，用預(yù)冷PBS洗2遍，加入細(xì)胞裂解液，用細(xì)胞刮收集細(xì)胞，冰上裂解30 min，并吹打數(shù)次;4℃，離心10 min，轉(zhuǎn)移上清至新的離心管中，測(cè)定蛋白濃度，將各組蛋白濃度調(diào)成一致。

用10%SDS－PAGE分離蛋白質(zhì)，每個(gè)泳道蛋白上樣量20 μg;4℃條件下轉(zhuǎn)膜，置膜于5%脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗(1∶300)4℃過(guò)夜，再加入二抗(1∶2 000)室溫孵育2 h，化學(xué)發(fā)光顯色，計(jì)算機(jī)掃描分析。

1.7 RT－PCR法分析脂酰輔酶A氧化酶 mRNA表達(dá) 藥物作用24 h后，去除培養(yǎng)液，用預(yù)冷PBS洗2遍，用Trizol試劑提取神經(jīng)元總 RNA。以 GAPDH為內(nèi)參照，RT－PCR法測(cè)定待測(cè)mRNA的相對(duì)表達(dá)量。PCR擴(kuò)增條件為:95℃預(yù)變性5 min之后，95℃變性45 s、56℃退火45 s、72℃延伸45 s共29個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5 min。用凝膠成像系統(tǒng)分析PCR產(chǎn)物電泳條帶光密度值，表達(dá)水平以ACOX1 mRNA與GAPDH mRNA的光密度值之比表示。ACOX1的引物為:上游 5′－TCACGCAATAGTTCTGGCTCA－3′，下游 5′－CTGTGGTTCTGGTTCGCTTT－3′，產(chǎn)物406 bp;內(nèi)參照 GAPDH 的引物為:上游 5′－GCTGAGTATGTCGTGGAGT－3′，下 游 5′－TCTTCTGAGTGGCAGTGA－3′，產(chǎn) 物289 bp。

2 結(jié)果

2.1 培養(yǎng)液中Aβ含量 EA組Aβ含量〔(31.75±1.98)pg/ml〕較對(duì)照組明顯增高〔(28.01 ±1.82)pg/ml，P ＜0.01〕，而EA+Wy組的Aβ含量較EA組明顯降低〔(26.10±2.76)pg/ml，P ＜0.01〕。

2.2 APP和BACE1蛋白表達(dá)水平 EA組的APP蛋白表達(dá)較對(duì)照組顯著升高(P＜0.01)，而EA+Wy組的APP水平較EA組明顯降低(P＜0.01);與APP的變化相同，EA組的BACE1蛋白表達(dá)較對(duì)照組顯著升高(P＜0.05)，而 EA+Wy組的BACE1水平較EA組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)表 1，圖 1。

2.3 ACOX1 mRNA表達(dá)水平 EA組ACOX1 mRNA表達(dá)(1.83±0.42)較對(duì)照組略有升高，但差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義〔(1.28±0.25)，P ＜0.05〕，添加激活劑后，EA+Wy組 ACOX1 mRNA水平進(jìn)一步增加，達(dá)對(duì)照組的2.6倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義〔(3.35±0.32)，P＜0.01〕，與 EA 組相比升高了1.83倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)圖2。

表1 各組細(xì)胞APP和BACE1蛋白表達(dá)水平(±s，n=6)

表1 各組細(xì)胞APP和BACE1蛋白表達(dá)水平(±s，n=6)

與對(duì)照組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01;與EA組比較:3)P＜0.05，4)P＜0.01

組別APP BACE1對(duì)照組0.32±0.07 0.19±0.07 EA組 0.92±0.172) 0.35±0.051)EA+Wy組 0.33±0.134) 0.22±0.023)

圖1 各組細(xì)胞APP和BACE1的蛋白水平

圖2 各組細(xì)胞ACOX1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平

3 討論

Patil等〔1〕通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)軟脂酸可誘導(dǎo)神經(jīng)元內(nèi)Aβ生成關(guān)鍵酶BACE1蛋白表達(dá)升高和tau蛋白磷酸化〔3〕;本實(shí)驗(yàn)我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)二十烷酸不僅增加了APP和BACE1的蛋白表達(dá)，同時(shí)也增加了皮質(zhì)神經(jīng)元Aβ的生成量。本結(jié)果提示飽和脂肪酸可通過(guò)影響APP代謝而促進(jìn)Aβ生成。

PPARα在調(diào)節(jié)脂肪酸分解代謝中具有關(guān)鍵作用。PPARα結(jié)合配體后被激活，與維甲酸X受體結(jié)合成異二聚體，再與靶基因上游的過(guò)氧化物酶體增殖物反應(yīng)元件結(jié)合，調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。ACOX1是過(guò)氧化物酶體脂肪酸β－氧化途徑的關(guān)鍵酶，受PPARα的調(diào)控〔4〕。脂肪酸是 PPARα的自然配體，故在應(yīng)用EA后ACOX1 mRNA水平略有升高;應(yīng)用人工合成的PPARα激活劑 Wy14 643后，PPARα進(jìn)一步被激活，ACOX1 mRNA水平進(jìn)一步升高達(dá)對(duì)照組的2.6倍，同時(shí)明顯降低了EA促進(jìn)APP、BACE表達(dá)及Aβ產(chǎn)生的作用。EA的分解一部分在過(guò)氧化物酶體內(nèi)進(jìn)行，激活PPARα后ACOX1表達(dá)增加，有利于EA的分解，故激活PPARα有效降低了EA引起的Aβ生成。貝特類(lèi)降脂藥是PPARα的激活劑，有資料顯示應(yīng)用貝特類(lèi)藥物能降低AD的發(fā)生率〔5〕，本實(shí)驗(yàn)為闡明其內(nèi)在機(jī)制提供了新的依據(jù)。

氧化應(yīng)激被認(rèn)為是AD發(fā)病初期的一個(gè)最早期事件，可引起APP、BACE1表達(dá)增加，Aβ生成增多〔6〕;Aβ增多又引起氧化應(yīng)激加強(qiáng)，進(jìn)一步促進(jìn)Aβ產(chǎn)生形成惡性循環(huán)〔7〕;同樣神經(jīng)炎癥可增加Aβ生成〔8〕，Aβ增多沉積會(huì)進(jìn)一步引起慢性炎癥〔9〕。研究表明游離飽和脂肪酸既可引起細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激增強(qiáng)〔10〕，也會(huì)誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)〔11〕。Patil等〔1〕的研究也發(fā)現(xiàn)加入抗氧化劑可以降低軟脂酸誘導(dǎo)的BACE1的表達(dá)上調(diào)。本實(shí)驗(yàn)中EA引起Aβ生成增多、APP與BACE1表達(dá)升高，可能與脂肪酸引起的氧化應(yīng)激或炎癥反應(yīng)有關(guān)。

近年研究還顯示PPARα具有抗氧化應(yīng)激和抗炎作用，激活PPARα可增加抗氧化酶如超氧化物歧化酶的表達(dá)，抑制炎癥因子 IL－6、TNF－α 的產(chǎn)生和釋放〔12，13〕。PPARα 被認(rèn)為是抗神經(jīng)變性病藥物作用的新靶點(diǎn)〔14〕。本實(shí)驗(yàn)中激活PPARα降低EA誘導(dǎo)Aβ生成的作用是否與其抗氧化應(yīng)激和抗炎作用有關(guān)還有待進(jìn)一步研究。

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