老年性白內障晶狀體上皮細胞凋亡及caspase-3表達

何小杰 李延輝 徐 飛 袁煜宗 (東莞市石碣醫院眼科，廣東 東莞 523290)

老年性白內障的發病率不斷上升，已成為目前世界上第一位致盲眼病〔1〕。雖然手術一直是治愈老年性白內障，讓患者重見光明的主要手段，但手術畢竟用人工材料置換替代本身晶體的組織器官，從某種意義上是有所缺陷的;同時其手術風險及昂貴的手術設備、耗材等經濟原因也讓許多較貧困老年性白內障患者望而卻步。因此，深入研究白內障發病機制，通過預防白內障發生或延緩其發展的途徑來征服老年性白內障已成為一項十分有益的課題。研究表明，細胞凋亡在白內障的發病中起著重要的作用，且晶狀體上皮細胞(LECs)的凋亡是除先天性白內障以外的所有類型白內障形成的細胞學基礎〔2〕。caspase-3是近年來發現執行哺乳動物細胞凋亡的關鍵蛋白酶，一些研究資料顯示，caspase-3可能參與了LECs的凋亡和白內障的形成〔3，4〕。本研究通過研究老年性白內障患者及正常人LECs的凋亡情況及相關調控基因caspase-3的表達，進一步闡明LECs凋亡在老年性白內障患者發生過程中的分子生物學機制，為白內障的治療以及藥物的開發提供新的思路。

1 對象與方法

1.1 研究對象 2007年9月至2012年2月我院眼科收治的老年性白內障患者25例為研究組，其中男13例(13眼)，女12例(12眼)，年齡50～79歲，平均年齡(62.4±4.6)歲。所有病例均在常規白內障顯微手術術中采用連續環形撕囊，獲取其中央部的晶狀體前囊膜(直徑約5 mm)。另收集無白內障發生的成年人尸體解剖眼球的晶狀體前囊膜標本10例(標本來自暨南大學附屬第一醫院)為對照組。兩組取材標本均置入10%中性緩沖甲醛溶液中固定24～48 h，常規石蠟包埋，連續切片，厚度約 3 μm。

1.2 主要試劑 EnVision試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司，caspase-3山羊抗人多克隆抗體(工作濃度1∶50)均購自美國PTG公司。TUNEL檢測細胞凋亡試劑盒購自Roche公司。

1.3 TUNEL方法檢測LECs的凋亡 切片常規脫蠟、水化、3%H2O2滅活處理、蛋白酶K消化，PBS液洗滌3次后加入TUNEL反應液(含TdT和Bio-21-dUTP)，置37℃水浴箱1 h;終止后加入SAAP反應液，置37℃水浴箱30 min;用DAB顯色，蘇木素襯染，脫水，透明，封片，光鏡下觀察。用無DNA末端轉移酶的標記液代替TUNEL反應液設為陰性對照。結果判定:細胞核中有棕黃色顆粒者為陽性細胞，即凋亡細胞，而正常細胞核被染為藍色。每張切片隨機選取5個視野，每個視野計數100個細胞，計算凋亡細胞百分率:凋亡細胞與總細胞的比值即為上皮細胞凋亡率。

1.4 免疫組織化學染色 采用免疫組化Envision法檢測兩組LECs中caspase-3的表達。操作程序:切片常規脫蠟和水化后，置于3%H2O2滅活內源性過氧化氫酶，微波加熱修復抗原，10%正常血清封閉，滴加一抗(caspase-3)，4℃冰箱孵育過夜，滴加二抗-HRP多聚體，室溫孵育30 min，DAB顯色，蘇木素襯染，脫水，透明，封片，光鏡下觀察。PBS代替一抗為陰性對照，試劑盒提供的樣本片為陽性對照。染色結果判斷:LECs內見黃色或棕色顆粒為染色陽性。每張切片隨機選擇檢查5個視野，計數100個細胞，計數陽性細胞數，計算陽性細胞率。0%～5%為(－);5% ～10%為(+);20% ～35%為();35% ～50%為()。(+)～()記為陽性。

1.5 統計學方法 應用SPSS13.0統計軟件進行χ2檢驗法和等級相關檢驗。

2 結果

2.1 兩組LECs的凋亡情況比較 研究組LECs中可見胞核呈棕黃色顆粒的凋亡細胞，凋亡細胞百分率為(30.4±3.7)%。對照組LECs中偶見凋亡細胞，凋亡細胞百分率為(0.27±0.12)%，研究組顯著高于對照組(t=11.59，P＜0.01)。

2.2 兩組LECs中caspase-3蛋白的表達比較 研究組LECs中caspase-3蛋白的陽性表達率顯著高于對照組(t=12.05，P＜0.01)，表1。

表1 兩組LECs中caspase-3蛋白的表達比較

2.3 caspase-3表達與細胞凋亡數之間的關系 25例老年性白內障患者的LECs中caspase-3蛋白的表達與細胞凋亡數間呈正相關(r=0.621，P ＜0.01)。

3 討論

晶狀體的發展依賴LECs不斷增殖和分化，LECs作為晶狀體中唯一有分裂活性的細胞，對晶狀體纖維生長和生長質量、維持晶狀體內環境的穩定、保持晶狀體纖維滲透壓的穩定起著重要的作用。目前研究認為白內障的發生與LECs的凋亡有直接關系，凋亡可導致LECs的結構和功能受損，并隨之發生細胞骨架和晶狀體蛋白變性、大分子聚集等一系列生化改變，形成白內障〔5，6〕。但近年來的研究對老年白內障LECs是否存在細胞凋亡一直未有定論，對其具體分子生物學機制也尚不清楚。

Li等〔7〕用透射電鏡觀察正常及白內障患者晶狀體上皮細胞超微結構時發現:正常LECs形態規則，一般無凋亡發生，而白內障患者LECs中可見凋亡細胞。TUNEL法是經過不斷改進而發展起來的一種有效檢測細胞凋亡的技術，該方法有特異性，且在光鏡下可辨認單個散在分布的凋亡細胞。本研究結果進一步驗證了LECs凋亡與老年性白內障的發生密切相關。因此，綜合利用基因工程，免疫組化，免疫印跡等先進研究技術深入研究影響LECs凋亡的相關調節基因的作用及其機制，就可能抓住老年性白內障發病機制的主要環節，為其防治提供新的思路。

caspase是一組半胱氨酸蛋白酶家族，是近年來細胞凋亡分子生物學研究的重要發現。caspase-3是該家族中執行哺乳動物細胞凋亡的關鍵蛋白酶，細胞經氧化劑、紫外線等誘因刺激之后，caspase-3從線粒體釋放并被激活，可使細胞質、細胞核及細胞骨架的重要蛋白質降解失活，從而發生細胞凋亡〔8〕。本研究結果與王凱軍等〔9〕和鄭廣瑛等〔10〕研究結果相似，提示caspase-3可能在老年性白內障形成過程中起重要作用。推測可能與caspase-3蛋白能參與酶切多種底物有關，其中晶狀體連接蛋白是其直接作用目標。LECs凋亡或其他損害，可使晶狀體內外鈣離子失衡，可激活caspase-3蛋白酶系統，從而致細胞骨架及晶體連接蛋白降解，最后導致晶狀體蛋白聚集，伴隨出現的水電平衡失調及其他一些病理改變，最終形成白內障。

綜上所述，LECs凋亡及caspase-3表達在老年性白內障的形成過程中起重要作用，相信隨著LECs凋亡及caspase-3表達調控機制逐漸被人們所認識，caspase-3上游基因和下游的作用底物及各種協作因子將被逐漸闡明，caspase-3表達抑制劑的研發，利用其減緩老年性白內障的形成及發展，可能會成為今后研究的新方向。

1 MeCayrty CA，Taylor HR.The genetics of cataract〔J〕.Invest Ophhtalmo Vis Sci，2001;42:1677-8.

2 李偉華，亢澤峰，李 凌，等.晶狀體上皮細胞凋亡調控基因與白內障的研究〔J〕.國際眼科雜志，2010;10(1):88-9.

3 Tamada Y，Fukiage C，Nakamura Y，et al.Evidence for apoptosis in the selenite rat model of catarac〔tJ〕.Biochem Biophys Res Commun，2000;275:300.

4 孫 紅，惠延年，王 琳，等.晶狀體上皮細胞凋亡與白內障發生的分子生物學機制〔J〕.中國臨床康復，2003;3(7):398-401.

5 黃秀榕，祁明信，汪朝陽，等.復方水蛭滴眼液抑制大鼠晶狀體上皮細胞凋亡及其對Bcl-2和Bax基因的調控〔J〕.中西醫結合學報，2007;5(6):681-5.

6 李桂榮，蘇冠方，周鴻雁.老年白內障晶狀體上皮細胞凋亡及凋亡基因的表達〔J〕.中國老年學雜志，2007;27(1):70-2.

7 Li WC，Kuszak JR，Dunn K，et al.Lens epithelial cell apoptosis appears to be a common cellular basis for non-congenital cataract development in humans and animals〔J〕.J Cell Biol，1995;130(4):169-81.

8 申存周.ATP、PARP、Caspase-3細胞凋亡和脹亡〔J〕.中國血液流變學，2009;19(1):150-2

9 王凱軍，姚 克，徐 雯，等.半胱氨酸天冬氨酸酶在過氧化氫誘導大鼠晶狀體上皮細胞凋亡中的表達〔J〕.眼科研究，2002;20(6):502-5.

10 鄭廣瑛，梁圓圓，王 倩.年齡相關性白內障晶狀體上皮細胞的Smac、caspase-3表達及死亡方式〔J〕.眼科研究，2010;28(4):351-5.