RECK、MMP-14在喉癌組織中的表達(dá)及臨床意義

左文娜，胡俊蘭，馮立春，劉衛(wèi)衛(wèi)，李 健，代保強(qiáng)

(1滄州市中心醫(yī)院，河北滄州 061001;2河北醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院)

近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是一類能降解細(xì)胞外基質(zhì)及血管基膜的重要蛋白酶類，具有促進(jìn)腫瘤侵襲及血管形成的作用。RECK(reversion-inducing-cysteine-rich protein with Kazal motifs)基因可通過(guò)抑制多種MMPs的表達(dá)，抑制腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移。2008年12月～2010年1月，我們采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了41例喉癌患者癌組織中RECK和MMP-14的表達(dá)，探討其在喉癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 取41例喉癌組織(喉癌組)、28例癌旁組織(癌旁組，距腫瘤切緣大于0.5 cm)及15例非喉癌患者(對(duì)照組)的喉部正常黏膜組織。所有腫瘤組織均經(jīng)病理學(xué)確診為鱗狀細(xì)胞癌，癌旁組織及喉部正常黏膜組織均經(jīng)病理證實(shí)為炎癥或正常黏膜。全部病例術(shù)前均未行放療、化療，臨床資料完整。喉癌組男36例，女5例;年齡42～76歲，中位年齡62歲;吸煙量 ＞400(年 ×支/日)者20例，≤400(年×支/日)者21例;癌腫直徑≤3 cm者24例，＞3 cm者17例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移13例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移28例;病理學(xué)分級(jí):G1組15例，G2組20例，G3組6例;喉癌分型:聲門(mén)上型21例，聲門(mén)型15例，聲門(mén)下型5例;臨床分期采用國(guó)際抗癌協(xié)會(huì)(UICC)2001年公布的TNM分類分期標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ、Ⅱ期16例，Ⅲ、Ⅳ期25例。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1 單細(xì)胞懸液制備 取組織0.5 g左右，剔除壞死組織、纖維、脂肪及結(jié)締組織。將組織放在120目不銹鋼網(wǎng)上，下置一平皿，將組織剪碎，用眼科鑷子輕輕搓組織塊，邊搓邊用生理鹽水沖洗，自然沉淀，收集細(xì)胞懸液。將混懸液用300目尼龍網(wǎng)過(guò)濾，去除細(xì)胞團(tuán)塊，收集細(xì)胞懸液。1 000 r/min離心2 min，棄上清液;再次1 000 r/min離心2 min，棄上清液。加入1 mL PBS將細(xì)胞懸浮，記數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/mL。

1.2.2 細(xì)胞的免疫熒光標(biāo)記 取0.1 mL單細(xì)胞懸液，分別加入RECK、MMP-14兔抗人多克隆抗體工作液各 0.1 mL，濃度為:1∶100，37 ℃水浴 30 min。加入PBS緩沖液10 mL混勻，1 000 r/min離心5 min，棄去上清液。加入羊抗兔FITC-IgG二抗工作液0.1 mL，避光室溫孵育30 min進(jìn)行熒光染色。加入PBS緩沖液10 mL混勻，1 000 r/min離心5 min，棄去上清液。去除未結(jié)合的熒光二抗。加入1 mL PBS液混勻，經(jīng)500目銅網(wǎng)過(guò)濾后上機(jī)檢測(cè)。

1.2.3 RECK和 MMP-14蛋白檢測(cè) 采用美國(guó)Beckerman Coulter公司生產(chǎn)的EPics-XLⅡ型流式細(xì)胞儀，激發(fā)光源為15 mW氬離子激光器，激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm，應(yīng)用ExPo32ADC進(jìn)行免疫熒光數(shù)據(jù)分析，用Muticycle AN分析軟件對(duì)DNA細(xì)胞周期擬合分析。檢測(cè)前以 flow-checkTMFlourPheres(10 μm)熒光微球(REF 6605359.Beckman Coulter，Inc.Fullerton，CA92835)作為標(biāo)準(zhǔn)樣品調(diào)整儀器CV值在2%以下。結(jié)果判定:RECK和MMP-14蛋白表達(dá)的定量分析，按照Morkve等提出的熒光指數(shù)(FI)表示RECK和MMP-14蛋白表達(dá)的相對(duì)含量。公式如下:FI=實(shí)驗(yàn)樣品的均道值/正常組織樣品的均道值，均道值=LogX-Mode×340。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)結(jié)果經(jīng)Excel整理，應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)，單因素方差分析、SNK檢驗(yàn)、直線相關(guān)及直線回歸分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組RECK和MMP-14表達(dá) 見(jiàn)表1。

表1 各組RECK蛋白、MMP-14蛋白FI表達(dá)量比較(±s)

表1 各組RECK蛋白、MMP-14蛋白FI表達(dá)量比較(±s)

注:與癌旁組、對(duì)照組比較，*P ＜0.05

組別 例數(shù) RECK蛋白 MMP-14蛋白喉癌組 41 0.759 3 ±0.105 8* 1.605 6 ±0.172 9*癌旁組 28 0.933 7 ±0.161 4 1.336 1 ±0.155 7對(duì)照組15 0.999 9 ±0.103 2 0.999 9 ±0.800 3

2.2 RECK蛋白和MMP-14蛋白的表達(dá)與喉癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系 見(jiàn)表2。喉癌組織中RECK蛋白和MMP-14蛋白之間呈負(fù)相關(guān)(r=－0.629，P＜0.01)。

表2 RECK及MMP-14表達(dá)與喉癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系

3 討論

RECK是1998年日本學(xué)者Takahashi等發(fā)現(xiàn)的一種新的腫瘤抑制基因，具有獨(dú)特的抑制基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)與活性的功能，可抑制腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移及血管生成。許多研究表明，RECK基因在肺癌、結(jié)腸直腸癌、胰腺癌等組織中低表達(dá)，其作為一個(gè)獨(dú)立因素與患者預(yù)后密切相關(guān)，高表達(dá)的RECK腫瘤組織具有較小的侵襲性，且患者有更高的生存率［1，2］。Song等［3］報(bào)道，52%的胃癌組織RECK表達(dá)缺失，且與腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)。李晟磊等［4］報(bào)道，食管癌RECK的表達(dá)明顯低于正常食管組織，且與腫瘤的分化程度、浸潤(rùn)深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示RECK在喉癌組織中的表達(dá)低于癌旁組織及正常黏膜組織，提示RECK在喉癌組織中的低表達(dá)可能與喉癌的發(fā)生有關(guān)。本研究還發(fā)現(xiàn)RECK的表達(dá)與喉癌臨床分型無(wú)關(guān)，而與病理分化程度、臨床分期及有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。喉癌的病理分化程度越低，臨床分期越晚，且有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的情況下RECK蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，提示RECK作為一種腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因參與了抑制喉癌的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。RECK基因可作為喉癌診斷治療及預(yù)后評(píng)估的重要病理學(xué)指標(biāo)。

MMPs家族是降解細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的主要酶類，在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移中具有重要意義。MMP-14是MMPs家族中的一種特殊蛋白酶，研究表明，MMP-14分解區(qū)蛋白可被以可溶形式分泌于細(xì)胞外。MMP-14能直接降解、破壞腫瘤患者的細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜，破壞阻擋腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)的屏障，并通過(guò)對(duì)MMP-2酶原的激活進(jìn)一步加強(qiáng)這種作用。本研究結(jié)果顯示，MMP-14在喉癌組織中高表達(dá)，其表達(dá)量與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理分化程度有關(guān)，喉癌的病理分化程度越低，臨床分期越晚，且有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的情況下MMP-14蛋白表達(dá)明顯升高。以上結(jié)果與劉冬玲等［5］及姚廣裕等［6］研究報(bào)道基本一致。由此推測(cè)MMP-14可促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)，侵襲和轉(zhuǎn)移。

RECK和MMP-14在LCC的表達(dá)及相關(guān)性研究發(fā)現(xiàn)RECK通過(guò)抑制MMP-14的加工中必需的水解酶，調(diào)控MMP-2的活化。RECK能通過(guò)調(diào)節(jié)MMP-2、MMP-9、MMP-14的活性而抑制腫瘤的入侵和轉(zhuǎn)移。本研究觀察到RECK蛋白和MMP-14蛋白之間有顯著的線性相關(guān)關(guān)系，為負(fù)相關(guān)。說(shuō)明RECK有可能通過(guò)下調(diào)MMP-14的表達(dá)而抑制喉癌的侵襲作用，但具體機(jī)制有待進(jìn)一步闡明。

綜上所述，RECK和MMP-14與喉癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，有可能成為判斷腫瘤侵襲性及預(yù)后的一項(xiàng)參考指標(biāo)。

［1］Takemoto N，Tada M，Hida Y，et al.Low expression of reversioninducing-cysteine-rich protein with Kazal motifs(RECK)indicates a shorter survival after resection in patients with adenocarcinoma of the lung［J］.Lung Cancer，2007，58(3):376-383.

［2］Clark JC，Thomas DM，Choong PF，et al.RECK-a newly discovered inhibitor of metastasis with prognostic significance in multiple forms of cancer［J］.Cancer Metastasis Rev，2007，26(3，4):675-683.

［3］Song SY，So HJ，Nam E，et al.Expression of reversion-inducingcysteine-rich protein with Kazal motifs(RECK)as a prognostic indicator in gastric cancer［J］.Eur J Cancer，2006，42(1):101-108.

［4］李晟磊，趙秋民，劉宗文，等.食管鱗癌中RECK和MMP-9蛋白表達(dá)相關(guān)性及臨床病理意義［J］.世界華人消化雜志，2007，15(10):1082-1086.

［5］劉冬玲，李娜萍.MMP-14、VEGF、E-cadherin與子宮頸癌生物學(xué)行為的相關(guān)性研究［J］.華中科技大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2006，35(6):774-777.

［6］姚廣裕，林鵬，于軍業(yè)，等.MMP-14在乳腺癌中的表達(dá)及臨床意義［J］.腫瘤防治研究，2005，32(5):268-270.