胃癌患者p16基因啟動子甲基化檢測及其臨床意義

楊羅庭，徐 偉，劉壽行，吳一中，劉 鵬

(1沅江市人民醫院，湖南沅江 413000;2湖南省人民醫院)

p16基因是一種重要的細胞周期負調控基因，抑制細胞增殖，被認為是重要的抑癌基因。研究表明，p16基因的失活與胃癌的分化、浸潤、淋巴結轉移及預后有關。其失活機制有突變、缺失和甲基化3種。其中前兩種機制僅在不到10%的腫瘤中發生，而啟動子區的異常甲基化是p16基因失活的主要原因，可導致胃癌細胞中p16蛋白表達缺失，同時也是胃癌發生過程中的早期事件［1，2］。2005年1月～2010年12月，我們檢測了58例胃癌患者癌組織中p16基因啟動子的甲基化狀態，旨在探討其與胃癌的發生、發展關系及在胃癌早期診斷中的應用價值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 58例行胃癌根治術的患者，男30例，女28例;年齡38～67歲。其中高中分化腺癌26例，低分化腺癌32例;腫瘤直徑＜3 cm 39例，≥3 cm 19例;有淋巴結轉移35例，無淋巴結注意23例;所有病例術前均未進行任何抗腫瘤治療。留取手術切除的胃癌變組織及相對應的癌旁組織，另收集30例健康體檢者胃黏膜(胃鏡取材)作為正常對照。所有標本取材均經患者及家屬的同意并簽署知情同意書。

1.2 p16基因啟動子CpG島甲基化檢測 NA提取及MSP引物設計:按臨床樣本DNA提取試劑盒(上海生工)說明書提取DNA，提取的基因組DNA經2%瓊脂糖電泳檢測其完整性，經紫外分光光度計檢測 A260/A280 為 1.8 ～2.0。取 45 μL DNA 用0.2 mol/L NaOH變性處理，向變性DNA中加入新鮮配制的10 mmol/L氫醌30 μL及36 mol/L亞硫酸氫鈉520 μL，樣品混勻后置于55℃水浴20 h。處理后的DNA用Wizard DNA Purification Systems試劑盒(Promega公司提供)純化后，溶入50 μL三蒸水中立即使用或放入－20℃冰箱備用。MSP引物參照文獻［3，4］設計甲基化和非甲基化引物(見表1)，由大連寶生物技術公司合成。PCR反應在AB9700熱循環儀上進行。反應總體積20 μL，2×Hotstart PCR Master Mix 10 μL，模板 2 μL(約 30 ng)，上下游引物(10 pmol/l)各 1 μL，加水至 20 μL，混勻后稍離心。反應條件如下:甲基化特異性的p16基因引物:95℃預變性5 min，95℃變性30 s，65 ℃退火30 s，循環35 次，72 ℃ 45 s，72 ℃延伸7 min，產物4℃保存。未甲基化特異性的p16基因引物:95℃預變性5 min，95℃變性30 s，60℃退火30 s，循環 35 次，72 ℃ 45 s，72 ℃延伸7 min，產物4℃保存。PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳，生物素Goldview染色，紫外燈下觀察結果并照相。分析p16基因甲基化與胃癌臨床病理特征的關系。

1.3 統計學方法 采用統計分析軟件SPSS13.0進行χ2檢驗或者Fisher精確檢驗。相關性分析采用Spearman檢驗。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 p16基因甲基化表達 58例胃癌組織標本中，26例(44.8%)在p16基因啟動子區域呈現異常甲基化;58例癌旁組織標本中，5例(8.6%)在p16基因啟動子區域呈現異常甲基化。30例正常胃黏膜組織標本未檢測到甲基化的存在(P均＜0.05)。

2.2 p16基因甲基化和臨床病理參數的關系 見表1。

表1 p16甲基化與胃癌臨床病理特征的關系

3 討論

抑癌基因啟動子區CpG島的異常甲基化導致其功能失活是其參與腫瘤發生的重要機制之一，也是目前表觀遺傳學研究的熱點之一。p16基因甲基化現象頻繁出現于肺癌、肝癌及結腸癌等各種不同的癌標本及腫瘤細胞株中，該基因甲基化可能是導致p16表達下調或無表達的主要原因之一。Jang等［5］的研究發現，p16抑癌基因啟動子超甲基化也是胃癌發生中的早期常見事件。p16基因位于人類染色體9p21區，其主要作用是在“cyclinD1-CDK4-PRb-ERF”環路中其負反饋調節作用，p16基因的任何變異都會導致上述環路無限制地進行，細胞過度增殖，使G1期未充分發育的細胞提前進入S期，導致癌癥的發生［6］。本研究結果表明p16啟動子CpG島甲基化率:胃癌組織＞癌旁組織＞正常組織，胃癌組織甲基化率為 44.8%，與國外報道［7，8］基本一致。由于在胃癌癌旁黏膜中常發生腸上皮化生、慢性萎縮性胃炎、異型增生等癌前病變，故本研究對胃癌組織、癌旁組織及正常胃黏膜組織甲基化狀態均進行了檢測，結果顯示胃癌組織甲基化率顯著高于癌旁組織及正常胃黏膜組織，說明p16啟動子CpG島甲基化不僅參與了胃癌的發生而且與胃癌的發生、發展密切相關。

本研究結果顯示，胃癌患者p16基因甲基化與患者的性別、年齡、腫瘤大小及浸潤深度無關，而與淋巴結轉移有關。即發現發生淋巴結轉移的胃癌組織p16基因的異常甲基化顯著高于未發生淋巴結轉移者，提示p16基因異常甲基化與胃癌的淋巴結轉移密切相關，可作為判斷胃癌患者是否發生淋巴結轉移的指標之一。

總之，對可疑胃癌組織的p16基因啟動子進行甲基化檢測，再結合胃鏡、病理學及其它一些實驗手段，有望提高胃癌的早期檢出率。在此基礎上隨著甲基化抑制因子去甲基化治療的臨床應用進一步發展，可望為胃癌的治療開辟新途徑。

［1］Kanyama Y，Hibi K，Nakayama H，et al.Detection of p16 promoter hypermethylation in serum of gastric cancer patients［J］.Cancer Sci，2003，94(5):418-420.

［2］Bae SC，Choi JK.Tumor suppressor activity of RUNX3［J］.Oncogene，2004，23(24):4336-4340.

［3］Luo D，Zhang B，Lv L，et al.Methylation of CpG islands of p16 associated with progression of primary gastric carcinomas［J］.Lab Invest，2006，86(6):591-598.

［4］Herman JG，Graff JR，Myohanen S，et al.Methylation-specific PCR:A novel PCR assay for methylation status of CpG islands［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1996，93(18):9821-9826.

［5］Jang TJ，Kim DI，Shin YM，et al.p16(INK4a)Promoter hypermethylation of non-tumorous tissue adjacent to gastric cancer is correlated with glandular atrophy and chronic inflammation［J］.Int J Cancer，2001，93(5):629-634.

［6］Ohtani N，Yamakoshi K，Takahashi A，et al.The P16INK4a-RB pathway:molecular link between cellular senescence and tumor suppression［J］.J Med Invest，2004，51(3-4):146.

［7］Shim YH，Kang GH，Ro JY.Correlation of p16 hypermethylation with p16 protein loss in sporadic gastric carcinomas［J］.Lab Invest，2000，80(5):689-695.

［8］Ding Y，Le XP，Zhang QX，et al.Methylation and mutation analysis of p16 gene in gastric cancer［J］.World J Gastroenterol，2003，9(3):423-426.