弓形蟲MIC3基因真核表達質粒的構建及其在BHK細胞中的表達

(貴州省疾病預防控制中心，貴陽 550040)

弓形蟲是一種機會性致病、專性細胞內寄生的原蟲，能廣泛寄生于人體所有有核細胞中，人群普遍易感。孕婦感染弓形蟲易造成胎兒先天性感染，導致流產、死胎、畸形或智力障礙［1］。弓形蟲病也是引發AIDS、腫瘤、器官移植患者等免疫功能缺陷或低下患者死亡的重要原因［2］。弓形蟲病臨床表現復雜，診斷困難，目前其診斷主要依靠免疫學檢測的方法，但目前國內研制的弓形蟲丙診斷試劑盒良莠不齊，重復性差［3］，加大了確診難度。弓形蟲微線粒體蛋白(MIC3)在蟲體入侵宿主細胞早期階段發揮重要作用，并能刺激機體產生特異抗體［4～6］。2011～2012年，我們構建MIC3基因真核表達質粒并轉染幼地鼠腎細胞(BHK)，以期獲取特異性MIC3表達蛋白，為研究其免疫反應源性及弓形蟲病診斷試劑盒奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 弓形蟲RH標準株(RH株)，DH5α菌株由貴州省慢性病防治研究所保存保存，PCDNA 3.0真核表達載體由中山醫科大學惠贈;BHK細胞由貴州省疾控中心病毒科提供，HifectinⅡ真核細胞轉染試劑來至購于普利萊基因技術有限公司。1.5 kg雄性新西蘭兔由貴陽醫學院動物中心提供。基因組DNA抽提試劑盒、質粒抽提及DNA膠回收試劑盒、TaqDNA聚合酶、限制性內切酶SaⅡ、HindⅢ、T4DNA連接酶及dNTP等均為上海生物工程技術服務有限公司產品。

1.2 MIC3真核表達質粒構建

1.2.1 PCR引物設計與合成 根據NCBI網絡發布的TOX-RH-SSI MIC3基因序列利用Primer 5軟件設計一對引物，并于引物的5端分別引入限制性內切酶SaⅡ、HindⅢ識別位點保護性堿基。引物序列:P1:5/-GCGTCGACAAAATGGCGCTGTTGCACGCGC-3/(下劃線表示SaⅡ酶切位點序列)/;P2:5/-CCCAAGCTTTCACTGCTTAATTTTCTCACAGC-3/(下劃線表示HindⅢ酶切位點)，由上海生工公司合成。

1.2.2 RH株MIC3擴增、回收 取接種RH株弓形蟲3 d的小鼠腹腔液，PBS沖洗腹腔2次，3 000 r/min離心10 min，棄其上清;按基因組DNA抽提試劑盒說明書步驟提取RH株弓形蟲基因組DNA進行PCR擴增。反應總體積為25 μL，引物P1、P2各2.5 μL(5 pmol/μL);模板 DNA 5 μL;雙蒸水 8.5 μL;Taq 聚合酶0.4 μL(5 unit/μL);反應參數:第 1～2 循環95 ℃、45 s，59 ℃、60 s，72 ℃、90 s，第 3 ～33 循環 94℃、30 s，59℃、40 s，72 ℃、60 s;最后循環72℃、5 min，4℃ 5 min。擴增產物經0.8%瓊脂糖電泳觀察;按照柱式DNA膠回收試劑盒操作步驟回收擴增產物。

1.2.3 MIC3真核表達質粒鑒定 將回收并純化的MIC3和真核表達質粒PCDNA3.0分別用適量的限制性內切酶SaⅡ、HindⅢ消化，并用氯仿提純，將純化后MIC3片段和真核表達質粒PCDNA按4∶1的比例混合，并在 T4DNA連接酶的作用下連接到PCDNA3.0質粒載體上，構建PCDNA-MIC3并轉入感受態細胞DH5α 中，鋪于SOB(含 IPTG、X-Gal、氨卞青霉素)平板上，37℃ 過夜培養。挑取SOB平板上白斑菌落，用含抗生素的LB培養液37℃培養過夜，UNIQ-10柱式質粒小量抽提試劑盒抽提重組質粒，進行單雙酶切和PCR鑒定。

1.2.4 弓形蟲速殖子裂解液抗原制備兔高免血清蟲體分離純化，超聲粉碎，離心取上清，測定蛋白含量，按常規方法免疫新西蘭兔，于第2次加強免疫后1周采用ELISA法測定抗體效價。

1.2.5 重組質粒轉染 轉染前一天接種(0.5～2)×105個BHK細胞于24孔板內，當細胞覆蓋培養板表面生長85% ～95%時，用25 μL無血清、無抗生素培養基分別稀釋1 μg重組表達質粒PCDNAMIC3及2～8 μL HifectinⅡ;混和稀釋后的 PCDNA3-MIC3和HifectinⅡ溶液輕輕混勻，室溫孵育15 min;用無血清培養基洗滌細胞1～2次并加入無血清無抗生素培養基，隨后加入前述稀釋混合物于培養板內，混合使之與細胞充分接觸，于37℃孵育細胞4 h后吸凈孔內液體，加入含血清的正常培養基，繼續培養24 h以上。分別于培養24、48、96 h后用0.25% 胰蛋白酶消化細胞，加DEPC處理的 PBS反復吹打細胞使其脫落，離心收集脫落細胞，－80℃凍存備用。以轉染空載質粒PCDNA3作為陰性對照。

1.2.6 表達產物SDS-PAGE電泳分析 用PBS離心洗滌轉染細胞，于沉淀中加入含PMSO的裂解液200 μL，重懸細胞，冰浴 20 min，12 000 r/min 離心 5 min，吸取上清進行電泳，SDS-PAGE濃縮膠5%，分離膠15%;電壓:濃縮膠為80 V，分離膠為160 V，電泳2 h。電泳結束后經考馬斯亮藍染色，脫色固定。

1.2.7 PCDNA-MIC3表達檢測 用等體積的PBS稀釋轉染細胞(觀察組)，反復凍融2次，超聲波處理，4℃下10 000 r/min離心10 min，取上清。另取空載PCDNA3懸液為對照組，然后分別用轉染細胞、培養液上清和正常BHK細胞包被酶標板，將兔抗弓形蟲高免血清按1∶1 000稀釋，山羊抗兔Ig GHRP按1∶5 000稀釋進行ELISA，DAB顯色，檢測兩組轉染細胞、培養液上清和正常BHK細胞PCDNA-MIC3表達。

2 結果

2.1 RH株弓形蟲MIC3基因體外擴增 以RH株弓形蟲基因組DNA為模板進行MIC3基因體外擴增，擴增產物經0.8%瓊脂糖電泳，在947～1 375 bp之間有一清晰明亮的條帶，與預期的弓形蟲微線粒體蛋白MIC3片段1 120 bp大小一致(見圖1)。

2.1 重組質粒酶切鑒定 經對空載質粒PCDNA 3.0和重組PCDNA-MIC3質粒進行單、雙酶切;以重組質粒為模板進行 PCR擴增，確認已成功構建PCDNA-NIC3重組質粒。見圖2。

2.3 表達產物SDS-PAGE電泳結果 重組質粒pc-MIC3能在BHK細胞內得到較高水平表達，電泳圖譜中顯示相對分子質量為39.8 KDa的蛋白條帶，與目標條帶蛋白分子量一致。見圖3。

圖1 PCR結果

圖2 重組質粒單雙酶切及PCR結果

圖3 表達產物的SDS-PAGE電泳結果

2.4 PCDNA-MIC3表達 見表1。分析表1結果，PCMIC3能在BHK細胞中高效表達并具有良好的免疫源性。

表1 兩組PCMIC3蛋白表達比較

3 討論

隨著分子生物學和基因工程等科學技術的迅猛發展，提高免疫診斷的特異性和敏感性，采用克隆表達的功能性蛋白作為抗原已成趨勢。近年來弓形蟲膜表面蛋白1(SAG1)、棒狀體蛋白2(ROP2)和致密顆粒蛋白7(GRA7)等相繼被表達，并用于弓形蟲病的檢測［6］。MIC3為弓形蟲微線粒體蛋白，發現于1991年，已有研究表明，弓形蟲在對宿主細胞的黏附和入侵過程中，伴隨微線粒體內容物的釋放，其中MIC3是蟲體分泌的非常重要的黏附因子，且與蟲體對宿主的識別和結合密切相關，并在蟲體入侵宿主細胞早期階段發揮重要作用［4，5］。有學者對弓形蟲MIC3蛋白的二級結構及B細胞抗原表位預測顯示，MIC3蛋白的性質較穩定，且有較多可能成為抗原表位的區域，能刺激機體產生特異性抗體，是目前作為弓形蟲病診斷的優勢抗原［7］。本研究用在真核細胞內具高效表達的良好載體PCDNA3.0構建弓形蟲MIC3重組質粒，并用構建的真核表達質粒轉染BHK細胞，經SDS-PAGE電泳，在轉染細胞裂解液中可見約為39.8 Kd的明顯條帶，間接ELISA分析表明，轉染細胞裂解液作為抗原能被弓形蟲特異性抗體所識別，培養液上清未檢測出相關抗原，顯示PCDNA3-MIC3重組質粒能在BHK細胞中高效表達，且表達蛋白能被弓形蟲特異性抗體所識別，具有良好的免疫源性，證實MIC3具有作為弓形蟲病診斷抗原的優勢。總之，本研究為PCMIC3重組蛋白純化，建立弓形蟲病敏感度高、特異性強的血清學診斷方法奠定了基礎。

［1］韓美君，李雅杰，景立新，等.孕婦弓形蟲感染胎盤垂直傳播狀況調查［J］.中國公共衛生，2006，22(1):14-15.

［2］彭祚全，揚連第.弓形體病診斷學［M］.武漢:湖北科學技術出版社，1998:35-38.

［3］何艷燕，蔣守富，馬杏寶，等.國內外16種弓形蟲診斷試劑盒的評估［J］.旅行醫學科學，2008，14(3):43-45.

［4］Dubremetz JF，Achbrou A，Bermudes D，et al.Kinetics and pattern of organelle exocytosis during toxoplasma gondii hostcell interaction［J］.Parasitol Res，1993，79(5):402-408.

［5］Soldati D，Dubremetz JF.Microneme proteins:structural and functional requirements to promote adhesion and invasion by the apicomplexan parasite Toxoplasma gondii［J］.Int J Parasitol，2001，31(12):1293-1302.

［6］黃澤智，趙晉英，李艷偉，等，重組抗原在弓形蟲病診斷中的應用［J］.中國病原生物學雜志，2011，6(10):779-782.

［7］江濤，馬立安，趙俊龍，等.弓形蟲MIC3蛋白質的二級結構及B細胞抗原表位預測［J］.長江大學學報(自科版)，2007，4(1):1-4.