三七總皂苷對百草枯中毒鼠肺組織NF-κB與血清IL-1β表達的影響

(昆明市延安醫院，昆明 650051)

百草枯(PQ)是目前廣泛使用的有機雜環類接觸性除草劑，人類中毒后可引起多臟器功能損害，其中以急性肺損傷(ALI)表現最為突出［1］，病死率高，至今仍無特效解毒劑。2010年6月，我們觀察了三七總皂甙(PNS)對PQ急性中毒大鼠肺損傷的治療作用并探討其作用機制，旨在為其臨床應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料 清潔級SD雄性大鼠150只，體質量200～250 g，昆明醫學院實驗動物中心提供。質量分數為20%的PQ溶液(山東三元工貿有限公司)，試驗前稀釋為1%。PNS注射液(昆明制藥廠)。IL-1β、NF-κB 試劑盒(大連寶生物)，Annexin VFITC細胞凋亡檢測試劑盒(凱基)。

1.2 模型制作及干預 將150只大鼠隨機分為三組:PQ組(60只)及PNS組(60只)均予質量分數為1%的PQ 25 mg/kg一次性灌胃染毒制作PQ中毒肺損傷模型，對照組(30只)予等量生理鹽水灌胃。制模前15 min PNS組陰莖靜脈注射PNS 50 mg/kg;PQ組和對照組分別予等體積生理鹽水陰莖靜脈注射。

1.3 觀察項目 ①肺組織損傷:分別在制模后6、12 h及1 d、3 d、5 d及7 d取血后處死大鼠，肺組織取材后常規石蠟切片，HE染色。光學顯微鏡下(×200)觀察肺組織結構變化。②血漿IL-1β水平:分別于制模后第6、12 h及1 d、3 d、5 d及7 d處理大鼠，取靜脈血離心，將血清置－70℃冰箱保存，操作嚴格按照說明書進行。③肺泡灌洗液中性粒細胞(PMN)NF-κB p65表達檢測:大鼠處死后分別予上述時間點收集支氣管肺泡灌洗液離心留取上清，沉淀重新懸浮后，進行密度梯度離心，PMN富集層進行瑞氏-姬姆薩染色，PMN純度＞88%方可進行下一步實驗。一抗采用兔抗NF-κB P65多抗，相應生物素標記的第二抗體及辣根過氧化物酶標記的鏈霉卵白素染色試劑盒。陰性對照用PBS代替一抗。體積較小且核分葉的細胞為PMN。操作過程按試劑盒說明書進行。鏡下隨機選取5個高倍視野，計算NF-κB p65陽性細胞(胞膜、胞質或胞核出現棕黃色著色顆粒)占細胞總數的百分比。④PMN凋亡率:BALF中提純的PMN懸液經PI染料避光染色10 min后，上流式細胞儀，染色陽性為凋亡細胞，計算凋亡細胞所占百分比。

1.4 統計學方法 采用SPSS13.5統計軟件，計量資料以±s表示，方差齊時采用LSD-t檢驗，方差不齊時采用秩和檢驗，P≤0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 肺組織損傷程度 對照組肺組織結構完整，無炎癥細胞滲出。PQ組肺間隔增厚，肺泡壁斷裂，大量PMN等炎癥細胞浸潤，且隨時間的延長炎性細胞浸潤增多，肺組織損傷程度加重。PNS組肺組織有同PQ組相似的病理表現，但相應時間點肺組織損傷程度較輕。

2.2 相關指標比較 詳見表1。

表1 各組鼠血清白介素-1β、NF-κB陽性率及 PMN 凋亡率(n=10， ±s)

表1 各組鼠血清白介素-1β、NF-κB陽性率及 PMN 凋亡率(n=10， ±s)

注:與對照組比較，#P＜0.00，與PQ組相應時間點比較，△P＜0.05

組別 IL-1β(μg/mL)NF-κB 陽性率(%)PMN 凋亡率(%)PNS 組6 h 8.56 ±1.28#△ 13.14 ±3.10#△ 25.34 ±4.42#△12 h 10.56 ±2.44#△ 15.47 ±3.48#△ 23.51 ±2.82#△1 d 12.64 ±2.82#△ 19.55 ±4.54#△ 20.78 ±1.69#△3 d 13.72 ±3.27#△ 24.62 ±6.45#△ 18.44 ±2.59#△5 d 9.48 ±2.10#△ 12.83 ±2.72#△ 21.50 ±3.63#△7 d 7.36 ±1.45 8.36 ±2.45 27.87 ±3.47 PQ組6 h 9.92 ±2.12# 16.92 ±4.53# 23.45 ±4.36#12 h 11.86 ±2.64# 20.72 ±5.24# 20.64 ±3.58#1 d 13.57 ±2.95# 26.55 ±5.78# 18.05 ±2.32#3 d 15.93 ±3.23# 30.43 ±7.15# 16.58 ±1.57#5 d 12.46 ±2.58# 15.46 ±3.67# 19.84 ±3.41#7 d 8.86 ±1.24 11.84 ±2.87 24.15 ±3.32對照組6 h 6.25 ±1.43 8.15 ±2.45 29.34 ±4.33 1 d 6.51 ±1.30 7.98 ±1.56 30.50 ±6.62 3 d 6.84 ±1.52 8.50 ±2.33 28.68 ±3.25

3 討論

PQ進入機體后，造成機體一系列應激反應，激活中性粒細胞及單核巨噬細胞，刺激神經、內分泌和免疫系統釋放大量細胞因子、炎癥介質等多種生物學效應因子。研究證實，上述炎癥介質在PQ中毒急性肺損傷及肺纖維化發生發展過程中起重要作用［2］。

PMN是由骨髓系造血干細胞分化而來的，產生速度快，存活期短(24～48 h)，一旦分化成熟即啟動其自發性凋亡［3］。研究表明，細胞凋亡是炎癥過程中調控PMN數量和反應性的有效措施，能夠保證炎癥反應的適度水平，避免炎癥反應擴大化，減少自身組織細胞損傷［4］。PMN在肺組織中大量聚集和持續激活，導致其發生呼吸爆發和脫顆粒，釋放蛋白酶和各種炎性介質等導致肺損傷。

IL-1β是介導急性炎癥反應的一種多肽，在大多數炎癥和免疫反應中是關鍵性的始動信號［5，6］，在肺纖維化發病過程中，IL-1β可調節輔助T淋巴細胞的活性，趨化粒細胞、巨噬細胞及淋巴細胞的積聚，介導肺泡炎癥期的損傷;還能刺激肺成纖維細胞增殖，對膠原合成有一定促進作用。有研究表明，急性呼吸窘迫綜合征死亡患者血清的IL-1β水平較生存者明顯升高，用其血清孵育正常人外周血淋巴細胞可促使淋巴NF-κB p65蛋白成分明顯增加，IL-1β mRNA表達水平明顯升高［7］。NF-κB作為調節細胞因子網絡的樞紐型環節，其活化可引起該網絡的調控失衡［8］:一方面能啟動眾多炎性細胞因子的基因轉錄和表達，進而形成“炎癥級聯反應”啟動肺部炎癥，并通過正反饋的級聯放大效應促進肺部炎癥的發展;另一方面，許多致肺纖維化因子基因的啟動子區域也含有NF-κB的固定的核苷酸κB序列，NF-κB活化后和含有κB序列的DNA結合，啟動這些基因的轉錄和表達，可促進肺纖維化的發生發展。Walley等［9］發現，小鼠氣管內注射脂多糖后，支氣管肺泡灌洗液細胞NB-κB的活性增強，伴有早期依賴NB-κB的細胞因子IL-1β和TNF-a表達增高。佟飛等［10］應用電泳遷移率改變分析法(EMSA)觀察到，NF-κB在PQ染毒大鼠肺組織中的表達增加，表明NF-κB可能參與了PQ中毒肺損傷的發生。

本研究PQ組IL-1 β和NF-κB p65水平明顯增加，PMN凋亡率降低，且隨時間的延長炎性細胞浸潤增多，肺組織損傷程度加重，在整個實驗過程中表現出動態變化。提示NF-κB p65和IL-1β可能參與了PQ中毒急性肺損傷，并可能進而影響后期肺纖維化的形成。PNS組 NF-κB p65和 IL-1β表達降低，PMN凋亡率提高，且肺損傷化程度減輕。其可能機制:①PNS能抑制PMN內NF-κB的活化，減少細胞間黏附分子表達及中性粒細胞浸潤作用［11］;②PNS可提高小鼠的血清溶血素水平，促進其單核-巨噬細胞碳廓清作用，增強小鼠的單核-腹腔巨噬細胞吞噬能力，提高小鼠NK細胞活性［12］。但其具體機制有待于進一步研究。本研究結果也顯示，NF-κB p65與IL-1β關系密切，兩者表達具有時間上的一致性，但兩者何為始動因素仍待進一步研究。

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