冰凍亞型紅細胞的保存及應用

(焦作市中心血站，河南焦作 454000)

低溫生物學原理應用于紅細胞保存，可使紅細胞壽命長達10 a，甚至延長到21 a［1］。隨著此項技術的不斷發展和成熟，目前冰凍亞型紅細胞在臨床上應用廣泛。近年來，我們將冰凍保存技術用于ABO亞型血標本選擇及保存，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 57.1%復方甘油溶液、9%NaCl注射液(北京博得桑特輸血器材公司);0.9%NaCl注射液、抗-A、抗-B、抗-D、抗-C、抗-c、抗-E、抗-e、抗-M、抗-N、抗-P1(上海血液生物醫藥有限責任公司);1.6%NaCl溶液(由9%和0.9%NaCl注射液按比例配制);無抗凝劑的真空采血管、PVC冷凍管、一次性塑料吸管(浙江拱東醫療科技有限公司);一次性注射器(河南曙光醫療器械集團);Eppendorf移液器(上海富眾生物科學有限公司);MDF-192型－80℃低溫冰箱(大連三洋冷鏈公司);HH.W21.600型電熱恒溫水浴箱(北京光明醫療儀器廠);LD5-2A型臺式離心機(北京雷勃爾公司)。

1.2 冰凍亞型紅細胞制備 血液標本選擇:＜6 d，抗凝良好;弱A、弱B與人源抗A、抗B的凝集強度為1+～2+s;各種傳染性指標檢測為陰性。①紅細胞甘油化:將血液標本離心后去血漿，得到濃縮紅細胞;用移液器將紅細胞準確轉入真空采血管，加塞(轉入紅細胞的體積占真空采血管容量的20%為宜，以防加甘油混勻時產生的氣體沖開瓶塞);用注射器按1∶2抽取甘油溶液，針頭穿入膠塞緩慢加入，邊加邊水平混勻;水平放置，室溫平衡30 min;離心去除多余甘油，混勻后分裝于PVC冷凍管，注明日期、血型及分裝量;平放入－80℃冰箱冰凍保存(標本量較大時，可用轉移袋進行甘油化，經適當分裝后冰凍保存)。②解凍融化:取出冰凍紅細胞，迅速投入37℃水浴，輕輕搖動使其融化;繼續放置10 min使其復溫。③洗滌去甘油:將復溫紅細胞轉入真空采血管;根據紅細胞冰凍時的分裝量，用注射器按1∶0.5抽取9%NaCl注射液，針頭穿入膠塞緩慢加入，邊加邊水平混勻;室溫平衡5 min，離心去上清;按1∶1加入 1.6%NaCl溶液，操作同前，平衡 5 min，離心去上清;打開膠塞，用一次性塑料吸管加入適量0.9%NaCl注射液(速度不需限制)，混勻后平衡5 min，離心去上清，重復操作1次;以MAP保存液稀釋為3～5%的紅細胞懸液，根據需要分裝于真空采血管中，于2～6℃冰箱保存備用。

1.3 冰凍亞型紅細胞相關質量指標檢測 ①制備效果:于冰凍亞型紅細胞制備的0 d由本站質控科用血細胞計數儀測定并計算紅細胞回收率，用鄰甲聯苯胺法測定上清Hb、體外溶血率，用過碘酸鈉法測定甘油殘留量;由筆者對紅細胞的 A、B、D、C、c、E、e、M、N、P1抗原進行檢測并與冰凍前進行對比。②儲存穩定性:分別于冰凍亞型紅細胞保存的10、20、30 d 進行。

1.4 統計學方法 采用SPSS15.0統計軟件，兩數比較，均采用χ2檢驗，計量數據以±s表示。檢驗水準 α =0.05。

2 結果

冰凍亞型紅細胞制備0 d及保存10、20、30 d時，質控科對相關質量指標的抽檢結果均符合GB18469的要求［2］，見表1。由表1可見，各項目各時點比較均無統計學差異。對紅細胞A、B、D、C、c、E、e、M、N、P1抗原進行檢測，其抗原反應的穩定性良好，抗血清的凝集強度與冰凍前對比均無明顯變化，與文獻報道一致［3］。

表1 冰凍亞型紅細胞相關質量指標的抽檢結果(n=10， ± s)

表1 冰凍亞型紅細胞相關質量指標的抽檢結果(n=10， ± s)

觀察項目0 d 10 d 20 d 30 d紅細胞回收率(%)82.80 ±2.31 － － －上清 Hb(g/L) 0.49 ±0.05 0.49 ±0.11 0.54 ±0.03 0.67 ±0.10體外溶血率(%) 16.10 ±3.34 17.00 ±3.84 19.10 ±0.35 20.70 ±0.69甘油殘留量(g/L)4.12 ±1.27 － － －

3 討論

本研究以真空采血管和一次性注射器作為基本器材，對小量ABO亞型血標本進行甘油化和梯度鹽水洗滌，甘油和NaCl溶液的加入量及加入速度容易控制，不需無菌條件，更無需特殊設備，操作簡單，成本低廉;制備的冰凍亞型紅細胞質量穩定可靠，用含有葡萄糖、腺嘌呤、甘露醇等成分的MAP保存液，可正常使用30 d。目前，冰凍儲存的ABO亞型標本共有23 例，分別為 1A2、2A2B、1A3、2B3、1Ax、3Bx、2AxB、5ABx、6B(A)，其中部分為家系調查標本。

用該方法制備的冰凍亞型紅細胞主要用于以下方面:①作為參考品對抗-A、抗-B試劑進行選擇:筆者曾對本地區使用的6家單克隆抗體試劑進行質量評估，其中包括用7個亞型紅細胞檢測抗體對弱抗原的識別敏感性，結果表明6家單克隆抗體試劑的效價、親和力及亞型標本檢出率均存在一定差異。最為意外的是，某廠家的單克隆抗體試劑因效價高、親和力強而被許多單位長期使用，但該試劑對7份亞型標本的檢出率卻為0，充分證明單克隆抗體試劑確實可導致亞型漏檢［4～6］，應引起使用單位及生產廠家的注意。本站從中選擇了兩家凝集效價高、親和力強、亞型標本檢出率高的試劑，分別用于體采科初檢和檢驗科復檢，在一定程度上提高了亞型檢出率。②用于某些ABO亞型的鑒定:由于試劑紅細胞的保存期只有3個月，而基層血站血型室的標本量因相對較少，往往使試劑利用率偏低，過期報廢現象嚴重，對使用頻率較低的紅細胞試劑，許多血站干脆就等有標本時再購買或直接將標本送上級采供血機構進行鑒定，有時會延誤患者的診斷和治療，也不利于工作人員檢測技術的提高。如果使用冰凍亞型紅細胞，就有可能解決這個問題。前期我站曾從無償獻血者中發現的2例B(A)血型，血清學鑒定無法區分AxB、B(A)，但B(A)血型的血清中因同時含有抗-A和抗-A1，所以除了與A1紅細胞凝集外，與A2紅細胞也凝集是其區別于AxB的特征之一，筆者使用冰凍的A2和A2B紅細胞進行檢測，將結果確定為B(A)血型。隨后將標本快遞至上海市血液中心進行分子生物學確認，2名獻血者均被證實為B(A)血型，基因型分別為B(A)02/O和B(A)04/O。③作為弱陽性質控品用于檢驗科的血型鑒定(應選擇儲存量比較大的標本)。如反應結果為陰性，提示可能存在導致亞型漏檢的影響因素，比如加樣量、試劑濃度、震蕩懸浮頻率等，應及時分析并糾正。④作為實驗標本用于對醫院供血庫進行血型血清學質控考評，也用于全市和站內輸血專業技能競賽。近年來大量基層一線工作者血型血清學的基礎知識和基本技術薄弱［7］，在ABO亞型檢測中表現的尤為突出，亞型漏檢率高，從而導致ABO定型錯誤并發生嚴重的輸血反應［8～10］，給安全輸血帶來一定困擾。我們將亞型紅細胞反復用于質控考評和技能競賽，一方面可強化工作人員的亞型概念，另一方面也使工作人員比較直觀地認識并了解亞型的血型血清學特點，以利于發現并檢出亞型。筆者統計了2006年1月～2009年12月本市79 704例無償獻血者的亞型檢出率僅為0.25/萬，而2010年1月 ～2011年12月61 332例無償獻血者的亞型檢出率卻為1.48/萬，亞型檢出率明顯提高。同時，醫院供血庫送檢的亞型標本也逐漸增多。

綜上所述，冰凍亞型紅細胞的應用對提高本地區ABO亞型檢測的整體水平，進一步保障臨床輸血安全有一定的促進作用。

［1］龔裕春，黃晨佳，邱穎婕，等.2組洗滌溶液制備冰凍亞型紅細胞的效果比較［J］.中國輸血雜志，2010，23(9):692-693.

［2］全血及成分血質量要求.中華人民共和國國家標準GB18469-2001［M］.中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫總局，2001:7-8.

［3］吳學忠，劉忠，呂蓉，等.凍干前后紅細胞血型及生物活性指標的檢測［J］.臨床輸血與檢驗，2011，13(4):316-319.

［4］方建華，劉玉振，溫濤.國產單克隆抗體試劑漏檢AX1例［J］.中國輸血雜志，2004，17(2):119.

［5］徐洪衛.街頭無償獻血漏檢AXB亞型1例［J］.臨床輸血與檢驗，2006，8(1):57.

［6］王宏法，劉玉振.國產血型定型試劑導致BX亞型漏檢1例原因分析［J］.中國誤診學雜志，2008，8(25):6152.

［7］蘇凱，蘭炯采，張德梅，等.恢復血型血清學技術培訓 提高臨床輸血水平［J］.臨床輸血與檢驗，2009，11(2):97.

［8］張旭，李劍平.455例ABO正反定型不符原因分析［J］.中國輸血雜志，2010，23(8):623-624.

［9］劉麗.Am 亞型1 例［J］.中國輸血雜志，2006，19(1):66-67.

［10］劉建嶺，劉樂霞，肖瑋，等.1個回族家系中發現8例B(A)亞型報告［J］.中國輸血雜志，2010，23(7):553-555.