DLC-1蛋白在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)及臨床意義

楊春香，張晴菊，顧國浩

(1無錫市第三人民醫(yī)院，江蘇無錫 214000;2蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院)

近年來，非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)發(fā)病率、病死率居高不下，晚期患者5年生存率僅為14%［1］。肝癌缺失基因(DLC-1)是一種新的候選抑癌基因，其在大多數(shù)腫瘤中表達(dá)下降或缺失，包括乳腺癌、胃癌、肝癌、前列腺癌、鼻咽癌等。進(jìn)一步研究表明，DLC-1基因的RhoGAP結(jié)構(gòu)域可能是其抗腫瘤作用的主要機(jī)制，DLC-1基因產(chǎn)物DLC-1蛋白在NSCLC癌組織中的表達(dá)情況目前鮮見報(bào)道。2011年5月～2012年1月，我們采用免疫組化法檢測NSCLC組織中DLC-1蛋白的表達(dá)，旨在探討其在NSCLC發(fā)生、發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 收集蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院和南京胸科醫(yī)院外科手術(shù)切除的新鮮NSCLC組織標(biāo)本40份(腫瘤組)，患者男28例，女12例;平均年齡60.1歲。鱗狀細(xì)胞癌18例，腺癌22例。TNM分期為Ⅰ期13例，Ⅱ期12例，Ⅲ期15例。高分化8例，中分化23例，低分化9例。區(qū)域性淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移20例;腫瘤直徑＞2 cm者27例。另選癌旁(距腫瘤邊緣＞5 cm)組織標(biāo)本40份(癌旁組)，兩組患者的一般資料無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

1.2 DLC-1蛋白表達(dá)檢測 采用免疫組化染色。所有病理標(biāo)本均經(jīng)10%中性甲醛液固定，石蠟包埋，制作4 μm切片。二甲苯脫石蠟3次，70%乙醇脫二甲苯兩次，3%H2O2處理10 min，單克隆鼠抗DLC-1抗體購自美國BD公司。具體操作按說明書進(jìn)行，染色前經(jīng)1×檸檬酸緩沖液微波修復(fù)10 min。DAB顯色，蘇木精復(fù)染。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn):DLC-1蛋白陽性染色主要定位于細(xì)胞質(zhì)，胞質(zhì)呈淺棕色至棕黃色。先按陽性細(xì)胞所占百分比計(jì)分:無陽性細(xì)胞為0分，陽性細(xì)胞≤10%計(jì)1分，11% ～50%計(jì)2分，51% ～75%計(jì)3分，＞75%計(jì)4分;再按染色強(qiáng)度計(jì)分，淺黃色計(jì)1分，棕黃色計(jì)2分，棕褐色計(jì)3分。以兩者乘積為最后得分:0為陰性(－)，1～2分為弱陽性(+)，3～4分為(++)，＞4分為強(qiáng)陽性(+++)。(++)和(+++)為陽性組，(－)和(+)為陰性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，Kruskal-wallis秩和檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn) α =0.05。

2 結(jié)果

2.1 DLC-1蛋白表達(dá) 腫瘤組及癌旁組DLC-1蛋白陽性率分別為42.5%(17/40)、0，P ＜0.05。

2.2 DLC-1蛋白表達(dá)與NSCLC臨床病理參數(shù)的關(guān)系 見表1。

表1 DLC-1蛋白表達(dá)與NSCLC臨床病理特征的關(guān)系

3 討論

DLC-1位于人類染色體 8p21.3-22，全長 3.8 kb，含有14個外顯子，編碼含1 091個氨基酸、分子量為123 kDa的蛋白質(zhì)。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，其在肝癌、乳癌、結(jié)直腸癌、胃癌、前列腺癌、卵巢癌、鼻咽癌等常見腫瘤中均出現(xiàn)低表達(dá)或表達(dá)缺失。DLC-1蛋白有3個主要功能結(jié)構(gòu)域，分別是 RhoGAP、SAM和START。DLC-1蛋白是一種GAPs蛋白，即GTP酶活化蛋白(GAP)，是Rho家族小分子蛋白。GAP是細(xì)胞內(nèi)多種信號分子的調(diào)節(jié)開關(guān)，能將GAP結(jié)合的活化狀態(tài)轉(zhuǎn)變成為失去活性的GDP結(jié)合狀態(tài)。RhoGAP作為Rho家族小分子鳥苷三磷酸酶的調(diào)節(jié)子，能促進(jìn)Rho蛋白的GTPase活性，從而將GTP結(jié)合的活化狀態(tài)轉(zhuǎn)變成為失去活性的GDP結(jié)合狀態(tài)，因而扮演了Rho家族蛋白負(fù)調(diào)控因子的角色［2］。目前認(rèn)為，DLC-1內(nèi)在的RhoGAP結(jié)構(gòu)域可能是其抗腫瘤的主要機(jī)制［3］。Yuan等［4］對無內(nèi)源性 DLC-1基因表達(dá)的肝癌細(xì)胞系轉(zhuǎn)染DLC-1cDNA后，證實(shí)DLC-1基因的表達(dá)對肝癌細(xì)胞的生長有抑制作用。此外，在肺癌、乳腺癌及鼻咽癌細(xì)胞系中的實(shí)驗(yàn)也得到了相同的結(jié)論。DLC-1蛋白為RhoA-C和Cdc42特異性的GTP酶激活蛋白，主要通過下調(diào)Rho蛋白的活性而抑制腫瘤細(xì)胞的生長［5］。Healy等［6］在對NSCLC的研究中也提出了DLC-1的抑制腫瘤細(xì)胞生長功能存在著RhoGAP依賴性和非依賴性途徑。

關(guān)于DLC-1蛋白在NSCLC中的表達(dá)目前報(bào)道較少。分析本文結(jié)果，腫瘤組DLC-1蛋白陽性率明顯高于癌旁組，表明DLC-1表達(dá)下降與NSCLC癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān);隨著腫瘤的分化程度降低，DLC-1表達(dá)逐漸減弱，提示DLC-1低表達(dá)水平與NSCLC癌細(xì)胞增殖活性有一定關(guān)系;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者DLC-1表達(dá)陽性率明顯低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，提示DLC-1低表達(dá)與腫瘤組織浸潤轉(zhuǎn)移的危險性有關(guān)。DLC-1表達(dá)與病理分期相關(guān)，表明 DLC-1表達(dá)降低與NSCLC癌的侵襲性具有相關(guān)性，而癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移活性、侵襲性通常是反映其生物學(xué)行為的指標(biāo)之一。

總之，DLC-1蛋白在NSCLC的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，其有望為腫瘤的臨床治療及預(yù)后判斷提供新的方法。

［1］于世英.肺癌分子靶向治療藥物的研究進(jìn)展［J］.醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2006，25(7):654-656.

［2］Liao YC，Si L，Devere White RW，et al.The phosphotyrosine-independent interaction of DLC-1 and the SH2 domain of cten regulates focal adhesion localization and growth suppression activity of DLC-1［J］.J Cell Biol，2007，176(1):43-49.

［3］Seng TJ，Low JS，Li H，et al.The major 8p22 tumor suppressor DLC-1 is frequently silenced by methylation in both endemic and sporadic nasopharyngeal，esophageal，and cervical careinomas，and inhibits tumor cell colony formation［J］.Oncogene，2007，26(6):934-944.

［4］Yuan BZ，Jefferson AM，Baldwin TK，et al.DLC-1 operates as a tunlor suppressor gene in human non-small cell lung carcinomas［J］.Oncogene，2004，23(7):1405-1411.

［5］Wong CM，Lee JM，Ching YP，et al.Genetic and epigenetic alteratiousof DLC-1 gene in hepatoeellular carcinoma［J］.Cancer Res，2003，22(63):7646-7651.

［6］Healy KD，Hodgson I，Kim TY，et al.DLC-1 suppresses non-smal cell lung cancer growth and invasion by Rho GAP dependent and independent mechanisms［J］.Mol Carcinog，2008，47(5):326-337.