微創(chuàng)血腫清除術(shù)對大鼠腦出血灶周圍組織TNF-α、IL-1β 表達(dá)的影響

(山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院，濟(jì)南 250021)

腦出血是一種病死率和致殘率很高的疾病，出血后可由多種細(xì)胞因子引起細(xì)胞死亡，導(dǎo)致繼發(fā)性腦損傷。微創(chuàng)血腫清除術(shù)是目前治療腦出血的重要手段，其能快速緩解血腫壓迫、減輕血腫釋放物對周圍腦組織的損傷。2010年11月～2011年3月，我們觀察微創(chuàng)穿刺前后大鼠腦出血灶周圍TNF-α、IL-1β水平變化，探討其影響及可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 健康成年Wistar大鼠90只，雄性，體質(zhì)量260～320 g，購自山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心(許可證:SCXK魯20030004)。大鼠腦立體定向儀(STOELTNGCO.620WHEATLANE 型，美國);微量注射儀(瑞沃德生命科技有限公司);微量注射器10 μL(上海高鴿工貿(mào)有限公司);IL-β、TNF-α 抗體(均為非結(jié)合多克隆兔抗體)，SP免疫組化試劑盒及DAB顯色試劑盒(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 模型制備及干預(yù) 將90只大鼠隨機(jī)分為模型組、微創(chuàng)組及對照組各30只。模型組及微創(chuàng)組參照Rosenberg等［1］報(bào)道的方法制備腦出血模型:術(shù)前禁食，自由飲水;10%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔麻醉，大鼠俯臥位固定在立體定位上，沿頭皮正中切一長約10 mm切口，無菌操作暴露前囟，于前囟前0.2 mm中線旁開3 mm處鉆一直徑為0.5 mm的小孔，進(jìn)針深度為5.5 mm(尾殼核位置)。剪尾取血，在8 min內(nèi)用微量進(jìn)樣器緩慢注入50 μL自體未抗凝動脈血，注血結(jié)束后留針10 min后緩慢退針，局部用骨蠟封閉后縫合皮膚。對照組只開顱，不進(jìn)行任何其他操作。模型制作成功(Bederson評分［2］≥2分;0分為無神經(jīng)功能缺損;1分為前肢出現(xiàn)屈曲，即提尾懸空試驗(yàn)陽性;2分為一側(cè)推抵抗力下降，即側(cè)向推力試驗(yàn)陽性，伴前肢屈曲，無轉(zhuǎn)圈行為;3分同2級行為，伴自發(fā)性旋轉(zhuǎn)即提尾懸空試驗(yàn)陽性)后4 h，模型組不進(jìn)行干預(yù)，分別于各個(gè)時(shí)間點(diǎn)斷頭取腦;對照組靜注向顱內(nèi)注射生理鹽水50 μL，手術(shù)方法同模型組;微創(chuàng)組將大鼠重新麻醉后固定在定位儀上，坐標(biāo)值同前，用頭皮針連接微量注射器抽取尿激酶 10 μL［3，4］，沿鉆孔處進(jìn)針深約 6.3 mm，緩慢注入尿激酶，5 min內(nèi)注完，等待約45 min后用1 mL注射器代替微量注射器連接真空管外端，利用負(fù)壓輕柔緩慢抽吸，抽吸量約為總量的30% ～40%，緩慢退針常規(guī)創(chuàng)口消毒后縫合皮膚。所有操作均在無菌條件下進(jìn)行。術(shù)畢將大鼠放回籠中飼養(yǎng)，自由活動進(jìn)食進(jìn)水。

1.2.2 出血灶周圍組織 TNF-α、IL-1β 表達(dá)檢測模型制作后各組在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)后6、12、24、48、72 h再次行戊巴比妥(0.1 mL/100 g)腹腔麻醉。開胸，暴露心臟及主動脈，用事先磨好的鈍頭50 mL注射器針頭從左心室尖插入心室，并進(jìn)入主動脈，動作輕柔，防止戳破心室及主動脈。手術(shù)剪將右心耳剪開，將37℃ 0.9%氯化鈉溶液從50 mL注射器緩慢推入動物的體循環(huán)，持續(xù)3～5 min(200 mL)至右心耳流出的液體基本無色，將灌流液換4%多聚甲醛磷酸緩沖液，繼續(xù)灌流5 min(約250 mL)。大鼠斷頭取血腫靠近皮層側(cè)腦組織約2 mm×2 mm×2 mm，留大腦置于4%多聚甲醛后固定24 h以上。取出固定液中腦組織標(biāo)本，常規(guī)脫水、石蠟包埋、固定，取尾狀核組織制作平面切片，免疫組化法檢測TNF-α、IL-1β表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較用t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

三組 TNF-α、IL-1β 表達(dá)見表1。

3 討論

表1 各組不同時(shí)點(diǎn)TNF-α、IL-1β表達(dá)水平比較(n=30，陽性細(xì)胞數(shù)，±s)

表1 各組不同時(shí)點(diǎn)TNF-α、IL-1β表達(dá)水平比較(n=30，陽性細(xì)胞數(shù)，±s)

注:與對照組比較，*P ＜0.05;與模型組比較，△P ＜0.05

組別6 h 12 h 24 h 48 h 72 h模型組TNF-α 7.31 ±0.34* 23.24 ±0.81* 28.17 ±0.63* 21.26 ±0.55* 17.06 ±0.52*IL-1β 20.37 ±4.16* 37.58 ±4.34* 44.29 ±4.21* 55.32 ±4.26* 73.71 ±3.98*微創(chuàng)組TNF-α 4.23 ±0.51△ 14.13 ±1.23△ 16.21 ±0.93△ 13.26 ±0.52△ 11.48 ±0.73△IL-1β 13.23 ±3.35△ 26.44 ±3.21△ 34.47 ±3.43△ 43.83 ±3.39△ 58.56 ±3.15△對照組TNF-α 2.32 ±0.30 2.51 ±0.51 3.25 ±0.43 2.96 ±0.28 2.08 ±0.35 IL-1β 11.05 ±5.30 17.32 ±3.20 21.61 ±4.08 25.91 ±3.8124.35 ±4.28

經(jīng)典理論認(rèn)為，腦出血后血腫逐漸增大產(chǎn)生的對正常腦組織的機(jī)械壓迫，可導(dǎo)致血腫周圍腦組織功能缺損，同時(shí)造成顱內(nèi)壓增高，大腦遠(yuǎn)隔部位受到影響。近年研究表明，自發(fā)性高血壓性腦出血后，由于釋放凝血酶、細(xì)胞毒性物質(zhì)及其他分解產(chǎn)物，造成炎癥細(xì)胞浸潤，從而導(dǎo)致腦水腫及神經(jīng)細(xì)胞凋亡，進(jìn)而炎性因子的釋放引起附近腦組織損害，進(jìn)一步造成血腦屏障的破壞［5，6］。急性期出血灶周圍腦組織表達(dá)包括TNF-α、IL-1β等在內(nèi)的多種炎性細(xì)胞因子。TNF-α是一種具有廣泛生物學(xué)功能的細(xì)胞因子，其通過促進(jìn)凝血、增加內(nèi)皮細(xì)胞通透性及誘導(dǎo)黏附分子或其他炎性介質(zhì)等表達(dá)，增加血腦屏障的通透性，加重腦損傷。IL-1β是觸發(fā)免疫和炎性反應(yīng)的重要介質(zhì)，可以通過刺激內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)白細(xì)胞黏附分子，使白細(xì)胞聚集于缺血腦組織，從而加重腦缺血損傷。資料表明，IL-1β作為一種炎癥和免疫源性細(xì)胞因子，不僅能夠協(xié)同其他細(xì)胞因子促進(jìn)B、T細(xì)胞活化，且能誘導(dǎo)其他炎性介質(zhì)的產(chǎn)生，黏附分子的表達(dá)，增加白細(xì)胞浸潤，促進(jìn)NOS生成，使NO合成增加，誘導(dǎo)興奮性氨基酸和自由基產(chǎn)生，啟動多種細(xì)胞因子級聯(lián)反應(yīng)。炎癥細(xì)胞因子在腦出血后腦水腫和腦損傷中所起的作用日益受到重視。

腦出血的治療一直是神經(jīng)內(nèi)外科的重點(diǎn)和難點(diǎn)。外科治療可挽救重癥患者生命，但術(shù)后死亡率較高。盡可能多清除血腫、少損害正常組織、術(shù)后無感染和再出血是未來治療腦出血的發(fā)展方向，近年開展的顱內(nèi)血腫微創(chuàng)清除技術(shù)順應(yīng)了這種發(fā)展趨勢。微創(chuàng)穿刺治療操作簡便，可以早期清除血腫，降低顱內(nèi)壓，避免腦疝形成，有利于腦功能康復(fù)，具有創(chuàng)傷小，費(fèi)用少，不易損傷神經(jīng)，術(shù)后康復(fù)快，技術(shù)易掌握等優(yōu)點(diǎn)［7］。我國開展微創(chuàng)穿刺治療腦出血技術(shù)廣泛，技術(shù)已較為成熟，急性期臨床療效肯定［8，9］，但最佳時(shí)機(jī)的選擇尚無定論。單從手術(shù)角度考慮，血腫抽吸的理想時(shí)間為出血后4～8 d，這時(shí)血腫大部分液化，有利于清除，但是，這個(gè)階段血腫對腦組織的壓迫時(shí)間過長，腦損傷恢復(fù)可能性小，故遠(yuǎn)期療效不佳。本研究選擇在腦出血后4 h左右作為抽吸時(shí)間點(diǎn)，血腫周圍的腦組織受損時(shí)間短，一旦血腫壓迫效應(yīng)解除，可以在盡早有效解除血腫對周圍組織的壓迫和血腫液分解產(chǎn)物引起的繼發(fā)性損害，挽救血腫周圍的半暗帶，神經(jīng)功能恢復(fù)可能性較大。本研究模型組 6、12、24、48、72 h TNF-α、IL-1β水平明顯高于對照組及微創(chuàng)組，對照組與微創(chuàng)組各時(shí)點(diǎn)比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。提示盡早進(jìn)行微創(chuàng)清除血腫可以減輕血腫周圍組織炎癥反應(yīng)，保護(hù)神經(jīng)組織。

綜上，超早期進(jìn)行微創(chuàng)血腫抽吸術(shù)可早期解除血腫壓迫，降低血液分解物對神經(jīng)細(xì)胞的損害作用，減少出血灶周圍TNF-α、IL-1β的表達(dá)，從而減輕腦水腫，最大限度降低腦出血后神經(jīng)功能的缺失，有利于神經(jīng)功能早期恢復(fù)。

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