VEGF-C、MT1-MMP在乳腺癌淋巴管生成過程中的共表達(dá)機(jī)制

姚廣裕，何 萍，楊名添，劉民鋒，葉長生

(1南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院，廣州 510515;2廣州醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院;3中山大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院)

淋巴道轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤最常見的轉(zhuǎn)移途徑之一，但轉(zhuǎn)移的機(jī)制尚不完全清楚。近年來，腫瘤新生淋巴管的發(fā)現(xiàn)使人們對腫瘤淋巴道轉(zhuǎn)移的機(jī)制有了新的認(rèn)識，即腫瘤的新生淋巴管在腫瘤的淋巴道轉(zhuǎn)移中可能起主導(dǎo)作用［1］。目前研究認(rèn)為，腫瘤細(xì)胞分泌的血管內(nèi)皮生長因子C(VEGF-C)可促進(jìn)腫瘤內(nèi)新的淋巴管形成［2］;膜型基質(zhì)金屬蛋白酶-1(MT1-MMP)也參與淋巴管生成過程［3］。而VEGFC和MT1-MMP的表達(dá)均與表皮生長因子受體2(ErbB2)基因有關(guān)［4，5］。近年來，我們觀察了乳腺腫瘤細(xì)胞淋巴道轉(zhuǎn)移過程中促進(jìn)VEGF-C和MT1-MMP分泌的共同機(jī)制，旨在認(rèn)識腫瘤淋巴管生成和淋巴道轉(zhuǎn)移的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 MT1-MMP、VEGF-C抗體(NeoMarkers公司);ErbB2抗體(Oncogene公司);Western blot二抗試劑盒(Santa Cruz公司);ECL發(fā)光劑(Amersham Biosciences公司);曲妥珠單抗(羅氏公司惠贈)。人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7為南方醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究所保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、分組及干預(yù) 乳腺癌細(xì)胞株MCF-7用含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)中將乳腺癌細(xì)胞株MCF-7分為4組:空白對照組不干預(yù)、轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)入ErbB2基因(將ErbB2基因克隆至真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1，經(jīng)測序鑒定后，用LipofectamineTM脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染入乳腺癌細(xì)胞MCF-7，轉(zhuǎn)染2 d后，改用含G418的培養(yǎng)基篩選出分別能夠穩(wěn)定表達(dá)ErbB2的MCF-7克隆)、空白質(zhì)粒組加入空白質(zhì)粒、加藥組轉(zhuǎn)染ErbB2后加入曲妥珠單抗，濃度為10 μg/L。

1.2.2 VEGF-C、MT1-MMP蛋白表達(dá)檢測 細(xì)胞長至70%匯合度時，4℃ PBS液洗2次，用含SDS細(xì)胞裂解液1 mL裂解，將蛋白在沸水中煮5 min，每孔50 μg上樣于聚丙烯酰胺凝膠，濃縮膠濃度為5%，分離膠濃度為10%。電泳條件:濃縮膠，恒壓50 V，40 min;分離膠，恒壓80 V，2.5 h。蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜，抗體1∶500稀釋，4℃孵育過夜;1∶1 500稀釋HRT標(biāo)記的二抗，室溫孵育2 h。以ECL為發(fā)光劑，暗室中X曝光時間為30 s，自動沖片機(jī)沖洗。

1.2.3 VEGF-C、MT1-MMP mRNA 表達(dá)檢測 按Trizol試劑盒說明抽提培養(yǎng)細(xì)胞總RNA后測吸光度值(A260/A280比值)，計算RNA純度;后吸取相同計量的RNA(5 μg)按照MBI公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒具體操作按說明合成cDNA。合成的cDNA經(jīng)PCR擴(kuò)增，MT1-MMP:5'-CAGAGAAGGCACACAAACGA-3'，5'-CACTGGTGAGACAGGCTTGA-3'，172 bp;VEGFC:5'-ACCTGCCCCACCAATTACA-3'，5'-GCCTCTTGTAAAGACTGGTT-3'，763 bp;GAPDH:5'-CGGAGTCAACGGATTTCGTAT-3';5'-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3'，320 bp。PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5 min;94 ℃、50 s，57 ℃、1 min，72 ℃、1 min 進(jìn)行30個循環(huán);72℃延伸10 min。產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠電泳后染色、攝片。

2 結(jié)果

2.1 VEGF-C、MT1-MMP蛋白表達(dá) 對照組和空白質(zhì)粒組僅檢測到少量的VEGF-C和MT1-MMP蛋白的表達(dá);轉(zhuǎn)染組可檢測到VEGF-C和MT1-MMP蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)，加藥組在加入藥物后，VEGF-C和MT1-MMP蛋白表達(dá)受到明顯抑制(見圖1)。

2.2 VEGF-C、MT1-MMP mRNA表達(dá) 對照組和空白質(zhì)粒組僅檢測到微弱的VEGF-C和MT1-MMP mRNA表達(dá)，而轉(zhuǎn)染組可檢測到VEGF-C和 MT1-MMP mRNA表達(dá)明顯增強(qiáng)，加藥組在加入藥物后，VEGF-C和MT1-MMP mRNA表達(dá)明顯受到抑制(見圖2、圖3)。

圖1 各組VEGF-C、MT1-MMP蛋白表達(dá)

圖2 各組VEGF-C mRNA表達(dá)

圖3 各組MT1-MMP mRNA表達(dá)

3 討論

淋巴道轉(zhuǎn)移是乳腺癌的常見轉(zhuǎn)移途徑，是決定乳腺癌分期和選擇治療方案最關(guān)鍵的因素之一。基礎(chǔ)和臨床研究表明，腫瘤新生淋巴管是促進(jìn)乳腺癌癌細(xì)胞的淋巴道轉(zhuǎn)移的主要因素［6，7］;無論乳腺癌、肺癌、甲狀腺癌還是胃癌、食管癌、大腸癌組織內(nèi)新生淋巴管標(biāo)記物的表達(dá)均與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)［6～8］。目前研究表明，腫瘤促使淋巴管新生是腫瘤細(xì)胞分泌的生長因子調(diào)控的，VEGF-C是其中的主要因子之一，其與淋巴上皮細(xì)胞表面的受體VEGFR3結(jié)合后，通過酪氨酸激酶信號系統(tǒng)發(fā)揮作用，促進(jìn)淋巴管上皮的增生、遷移和新的淋巴管形成［9］。

新生淋巴內(nèi)皮增生形成管狀結(jié)構(gòu)后，須伸穿入周圍基質(zhì)，方才能形成新的淋巴管網(wǎng)［10］，這一過程一定伴隨著腫瘤基質(zhì)的降解和重建，最終使新生淋巴管成為腫瘤內(nèi)間質(zhì)的組成部分。基質(zhì)降解和重建首先是一個基質(zhì)組分的酶解過程，參與這一過程的主要酶類是基質(zhì)金屬蛋白酶家族(MMPs)。MMPs是一族Zn2+依賴性內(nèi)肽酶，MT1-MMP屬于膜型的MMPs。MT1-MMP通過跨膜結(jié)構(gòu)域固定于細(xì)胞膜表面發(fā)揮作用，不僅可直接降解諸如膠原、纖維結(jié)合蛋白等基質(zhì)組分，且可激活MMP-2降解多種基質(zhì)成分。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，MT1-MMP降解基質(zhì)主要是通過后一種機(jī)制［11］。Nisato 等［3］研究發(fā)現(xiàn)，在體外淋巴上皮三維培養(yǎng)過程中，可以檢測到MT1-MMP mRNA的表達(dá)增加。Nakamura等不僅在體外淋巴上皮培養(yǎng)過程中檢測到MT1-MMP mRNA，且用MMPs抑制劑MMI270抑制MT1-MMP的活性能夠抑制淋巴上皮細(xì)胞的遷移能力。由此可見，MT1-MMP在淋巴管生成過程中發(fā)揮著重要作用。

目前，關(guān)于VEGF-C和MT1-MMP共表達(dá)機(jī)制的相關(guān)報道鮮見，VEGF-C或MT1-MMP與ErbB2關(guān)系報道亦較少。其中VEGF-C與ErbB2關(guān)系的研究報道結(jié)論比較一致。早期的研究多采用免疫組化的方法研究手術(shù)標(biāo)本中VEGF-C與ErbB2的關(guān)系，都認(rèn)為乳腺癌中VEGF-C的表達(dá)與ErbB2蛋白表達(dá)呈正相關(guān)［4，12］，且大膽的推測 ErbB2 基因可能調(diào)控VEGF-C 的表達(dá)［13］。Su 等［14］的研究從分子層面提示ErbB2信號系統(tǒng)的激活可增加VEGF-C的表達(dá)。但是，關(guān)于MT1-MMP與ErbB2關(guān)系的研究報道的結(jié)果很不一致，同樣采用免疫組化的方法，Mylona等［15］報道 MT1-MMP蛋白與ErbB2蛋白表達(dá)不相關(guān)，而 Ishigaki等［16］卻認(rèn)為二者有正相關(guān)關(guān)系。Jang等［17］的研究也提示證實(shí)ErbB2信號系統(tǒng)的激活可以增加MT1-MMP的表達(dá)。

本研究空白對照組、空白質(zhì)粒組僅檢測到少量的VEGF-C和MT1-MMP蛋白、mRNA的表達(dá);轉(zhuǎn)染組可以檢測到VEGF-C和MT1-MMP蛋白、mRNA表達(dá)明顯增強(qiáng);加藥組在加入藥物后，VEGF-C和MT1-MMP蛋白表達(dá)受到明顯抑制。提示VEGF-C和MT1-MMP在腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移過程中的表達(dá)存在某種共同的調(diào)控機(jī)制，揭示二者在腫瘤進(jìn)展中的相互作用關(guān)系。由此我們推測，在惡性腫瘤淋巴道轉(zhuǎn)移過程中，某些信號系統(tǒng)如ErbB2信號系統(tǒng)的激活可以同時促進(jìn)VEGF-C和MT1-MMP在腫瘤細(xì)胞的表達(dá)，此時VEGF-C可以促進(jìn)淋巴管上皮的增生、遷移，而MT1-MMP則通過降解腫瘤周圍的間質(zhì)，為新的淋巴管延伸清除基質(zhì)屏障，從而共同促進(jìn)新生淋巴管形成，促使腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移。

綜上所述，VEGF-C和MT1-MMP在乳腺癌中存在共同表達(dá)的機(jī)制，二者均受ErbB2基因的調(diào)控，MT1-MMP可能參與了乳腺癌的淋巴管生成。

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