串珠素在咀嚼肌中的表達及意義

朱 莉，王彥亮，黃志鋒，何 帥，周稚輝，麻健豐

(1溫州醫學院附屬口腔醫院，浙江溫州 325027;2溫州醫學院藥學院;3解放軍第118醫院)

細胞外機制(ECM)是由纖維性蛋白質、氨基多糖和蛋白聚糖等生物大分子組成的動態網絡結構，在維持生物結構的完整性、細胞信號轉導和細胞表型、功能的調節中均具有重要作用。串珠素是ECM中主要的蛋白聚糖成分，廣泛存在多種組織基底膜和軟骨基質中，與其他基質成分緊密結合并自行組成二聚體和其他的大聚合物。大量體外研究發現，串珠素在細胞生長和分化、組織化等方面發揮多種功能，可以通過調節生長因子的結合和活性，影響血管壁細胞、軟骨和骨細胞等多種細胞在發育期的增殖、遷移，并影響細胞與基質的黏附，在機體心血管系統和軟骨發育，血管、骨骼系統和神經肌接頭(NMJ)的生成與功能調控等多種生命過程中均具有重要作用。2010年5月～2011年12月，我們對串珠素基因片段進行克隆、擴增和蛋白表達，以獲取串珠素蛋白，并探討其在咀嚼肌中的表達特點。

1 材料與方法

1.1 材料 探針載體直接轉化，擴增，酶切，測序后，酶切片段，插入pET32a，表達，測序，表達全菌蛋白，Wetstern blot 1—測 his，Western blot 2—測抗串珠素，2次均在同一分子量處發現表達。牛串珠素基因(b串珠素)探針為Ray Rodgers教授(Reproductive Medicine Unit，Obstetrics ＆ Gynaecology，Adelaide University，SA，AUSTRALIA，5005)惠贈，全長183 bp，連接于pGEM-T Easy載體。

1.2 實驗方法

1.2.1 目的基因擴增和鑒定 用b串珠素-pGEMT Easy質粒轉化感受態大腸桿菌DH5α(質粒0.1 μg，DH5α 感受態菌200 μL，冰浴30 min后42 ℃熱休克90 s，)，涂布于(含 Amp 100 μg/mL)的 LB 平板上，37℃培養過夜。挑陽性菌，將陽性細菌在含Amp的瓊脂培養基中劃板，挑取單克隆菌落接種于含Amp LB培養液中37℃振蕩過夜。擴增后，用堿裂解法提取質粒，酚/氯仿抽提回收質粒，EcoR I+Sal I酶切，瓊脂糖凝膠電泳分析鑒定，并送DNA測序。

1.2.2 目的基因克隆和表達 將測序正確的串珠素片段插入到表達載體 pET32a中(DNA片段2.5 μL，載體 2.5 μL，0.1 M MgCl20.5 μL，Sal I 5 μL，16℃，4 h)，轉化感受態大腸桿菌DH5α，接種于AMP+LB平板。37℃培養過夜。挑取單克隆菌落接種于LB培養液中，37℃振蕩培養4 h。回收質粒，酶切，瓊脂糖凝膠電泳鑒定。DNA測序鑒定。鑒定正確后，挑選1%轉化后的細菌接種在新鮮的LB培養基中，37℃培養至對數生長期，0.2 mM IPTG誘導4 h，收菌，SDS-PAGE分析鑒定。以pET32a空載體轉化和未經誘導的細菌設為對照組。

1.2.3 融合蛋白表達檢測 采用Western blot法。表達全菌蛋白SDS-PAGE，200 mA低溫轉膜;5%脫脂奶粉封閉1 h后，鼠抗His抗體(1∶1 000)4℃封閉過夜。PBST(PBS中加入0.1%Tween-20)洗膜3次，每次10 min;羊抗鼠二抗(1∶5 000)封閉1 h;PBST洗膜3次，每次10 min;PBS洗膜3次，每次5 min;發光，顯影。陰性對照為pET32a誘導和未誘導菌蛋白。再次行Western blot，一抗采用鼠抗串珠素單抗，檢測融合蛋白表達情況。陰性對照仍然設為pET32a誘導和未誘導菌蛋白。

1.2.4 b串珠素抗血清制備 對雄性新西蘭家兔進行常規體檢，將重組的串珠素核心蛋白500 μg用PBS稀釋至1 mL，與等體積的Freund完全佐劑充分乳化后，在家兔皮下注射1 mL，7 d后再次在雙后腿淋巴結內注射100 μg抗原以加強免疫。以后每隔10 d進行一次加強免疫，5 W后取家兔全血，4℃過夜，4 000 r/min，4 ℃離心10 min，收集血清，－20 ℃保存。配置0.1 g/L瓊脂糖凝膠，行雙向免疫擴散試驗，測定抗體滴度。

1.2.5 免疫組化實驗 將成年大鼠脫頸處死，立即取材面部咀嚼肌，多聚甲醛固定過夜，梯度酒精脫水，石蠟包埋，5 μm石蠟切片。串珠素多克隆抗體工作濃度為1∶100，二抗為羊抗兔IgG(SABC免疫組化試劑盒，博士德公司，武漢)，工作濃度為1∶100。切片脫蠟至水，在室溫下用H2O2處理30 min，PBS洗5 min×2次，胰蛋白酶消化37℃ 30 min，PBS洗5 min×3次，50 mL/L正常羊血清封閉10 min，PBS洗5 min×3次。加一抗，對照組用正常羊血清代替一抗，4℃過夜。PBS洗5 min×3次，加二抗，37℃30 min。PBS洗5 min×3次，加SABC 37℃ 30 min。PBS洗5 min×3次，DAB顯色，蘇木素輕度復染。脫水，透明，封片，光鏡觀察。

2 結果

2.1 串珠素擴增和插入到表達載體后酶切電泳質粒擴增后酶切鑒定，瓊脂糖凝膠電泳顯示在100～200 bp間有新條帶出現(見圖1)(DNA marker:SD012)。擴增后所獲得的片段送DNA測序(寶泰克公司)，測序結果與原序列相同，說明擴增正確。將測序正確的串珠素片段插入到表達載體pET32a中，EcoR I+Sal I酶切后電泳鑒定，在100～200 bp處有穩定電泳條帶出現，顯示串珠素片段插入到pET32a中的連接反應正確(DNA marker:DGL2000，見圖2)。

圖1 b串珠素擴增后酶切電泳圖

圖2 串珠素片段插入到表達載體pET32a后酶切電泳圖

2.2 串珠素蛋白表達和分析 SDS-PAGE顯示在IPTG誘導的串珠素-pET32a轉化菌蛋白有新條帶出現，新條帶的分子量在35 kD附近，說明IPTG誘導下插入pET32a的串珠素可以進行高效的蛋白表達。對照組分別為未經IPTG誘導的串珠素-pET32a轉化菌和用pET32a空載體的轉化菌蛋白。Western blot示，未誘導的菌無表達，而融合蛋白的和pET32a轉化菌經誘導后均有蛋白表達，其中融合蛋白條帶相對分子質量大于pET32a誘導的蛋白條帶，說明插入pET32a載體的蛋白成功表達(見圖4)。

圖3 SDS-PAGE分析串珠素表達

圖4 Western blot顯示的融合蛋白表達

2.3 免疫組化染色結果 光鏡下觀察，串珠素在咀嚼肌中表達顯著，均勻分布在骨骼肌肌纖維細胞外的基質中，尤其在肌膜處明顯聚集呈帶狀分布(圖5)。

圖5 串珠素在骨骼肌中的分布

3 討論

串珠素是ECM中主要的蛋白聚糖之一［1］，分子量約為700 kD，由核心蛋白和4條硫酸肝素(HS)側鏈組成，與其他基質成分緊密結合并自行組成二聚體和大的聚合物。串珠素主要存在于骨、軟骨、血管、牙胚中，介導著細胞增殖分化及細胞信號轉導等［2，3］。組織來源不同的串珠素硫肝素側鏈不同，不同種屬的哺乳動物類串珠素核心蛋白序列上有同源性，不同組織細胞來源的串珠素側鏈結構差別較大，側鏈的變化對于其生物學活性具有明顯的影響。串珠素側鏈的HS帶有負電，通過其吸水性增加組織的容積，可以結合、釋放生長因子，使生長因子暫時失活，并在必要時恢復其活性，不僅具有生長因子儲存庫的作用，也是細胞黏附分子的重要配體。

骨骼肌再生是一個至今仍未完全被理解的過程，運動神經與骨骼肌間建立突觸連接的位置是運動神經與肌細胞相互誘導來確定的，長期以來肌纖維周圍的基膜一直被認為是這種調控作用的重要因素，但具體機制了解較少。近年來，隨著對NMJ中ACh受體(AChR)復合體研究的深入，揭示出基膜中的多種硫酸乙酰肝素蛋白多糖(HSPG)在此過程中起主導作用。運動神經末梢通過釋放的神經遞質可誘導突觸后膜上信號蛋白的積聚，使AChR復合體定位在突觸后膜上，其中串珠素是該過程中最重要的一種信號蛋白，被認為是AChR復合體在運動終板突觸后膜上定位的信號分子［4］。串珠素在NMJ處高表達，是NMJ處乙酰膽堿酯酶(AChE)的獨特受體分子，在把AChE定位在突觸基膜上的過程中發揮主要的作用［5］。AChE復合體在突觸后膜的定位是通過串珠素結合AChE和dystroglycan來達到的［6］。體外實驗已證實，在運動神經—肌肉共培養模型中，串珠素的存在能夠明顯促進二者間的相互誘導生長及突觸的形成。在NMJ形成后，串珠素還繼續對維持突觸的穩定發揮作用［7］。同時，串珠素還參與了骨骼肌再生過程中的復雜的調控機制，因其是細胞表面和ECM的主要成分，調控生長因子活性并影響細胞生長和分化［8］。

骨骼肌損傷后，變性的肌纖維釋放出多種信號，浸潤的炎細胞和重塑的ECM均能影響修復性肌形成的過程。在多種信號存在的情況下，衛星細胞活化、肌前體細胞的增生和分化等一系列過程都需要密切調控。Casar等［9］報道了注射氯化鋇誘導產生的小鼠骨骼肌細胞再生過程中觀察的HSPG表達情況，發現有幾種HSPG出現暫時性上調，包括syndecan-3、glypican、串珠素和syndecan-4。這些HSPG的表達增加與分化過程中早期標志物的表達相一致，并定位于新形成的肌管中。對缺血或毒性損傷，新形成的肌纖維在最初的基膜管中發育，這樣可以讓NMJ在原來的突觸位置形成。這種基膜位置信息的儲存依賴于HSPG，如agrin或串珠素。串珠素、glypican、syndecan-3和 probably syndecan-4是伴隨新形成的正在分化的肌管能被原位檢測到的幾種主要HSPG。體外結合試驗證實，ECM組蛋白H1能特異性結合串珠素，二者共同存在于再生的骨骼肌中，包括肌管培養基和再生骨骼肌的ECM。組蛋白H1與串珠素結合能顯著刺激成肌細胞的增生［10］。

本實驗設計通過基因工程方法表達串珠素核心蛋白，并制備特異性多克隆抗體，用以檢測串珠素在咀嚼肌等口腔組織中的表達和分布。本研究首先完成了對b串珠素基因的正確克隆和表達，建立了可以表達b串珠素的組織工程菌。pET32a載體上串珠素插入區的上游有His蛋白的表達序列，可作為在Western blot中檢測pET32a表達的標記。在以鼠抗His抗體作為一抗進行Western blot檢測時，融合蛋白的和pET32a轉化菌經誘導后均有蛋白表達，其中融合蛋白條帶相對分子質量大于pET32a誘導的蛋白條帶;而在以鼠抗串珠素為一抗進行Western blot檢測中，只有融合蛋白轉化菌經誘導后有蛋白表達，證明串珠素-pET32a轉化菌蛋白能表達串珠素，并能與鼠抗串珠素特異性結合。

本實驗通過條件誘導方法實現了串珠素核心蛋白的原核表達，而其較復雜的蛋白糖基化過程需要通過真核動物細胞表達來實現。用anti-串珠素單抗進行的Western blot表明原核表達的串珠素核心蛋白具有天然串珠素的免疫原性。因此本實驗的方法僅是利用其具有的免疫原性來實現抗體制備，而不能用來產生活性蛋白。免疫沉淀實驗證明了用其制備的多克隆血清可對串珠素核心蛋白產生特異性結合。另外，免疫組化實驗表明牛與鼠串珠素的免疫原性之間存在交叉，應為哺乳動物間串珠素序列的同源性所致。

串珠素通過參與基底膜成分的結合與組裝，對于維持基底膜結構與功能的完整性發揮著極其重要的作用。串珠素廣泛表達在咀嚼肌的ECM中，其中在肌膜等ECM的膜性結構中更是集中表達。

［1］Kuo C，Lim S，King NJ，et al.Rhinovirus infection induces extracellular matrix protein deposition in asthmatic and nonasthmatic airway smooth muscle cells［J］.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2011，300(6):951-957.

［2］Govindraj P，West L，Koob TJ，et al.Isolation and identification of the major heparan sulfate proteoglycans in the developing bovine rib growth plate［J］.J Biol Chem，2002，277(22):19461-19469.

［3］Handler M，Yurchenco PD，Iozzo RV.Developmental expression of perlecan during murine embryogenesis［J］.Dev Dyn，1997，210(2):130-145.

［4］Mishra M，Naik VV，Kale AD，et al.Perlecan(basement membrane heparan sulfate proteoglycan)and its role in oral malignancies:an overview［J］.Indian J Dent Res，2011，22(6):823-826.

［5］Rotundo RL，Rossi SG，Kimbell LM，et al.Targeting acetylcholinesterase to the neuromuscular synapse［J］.Chem Biol Interact，2005，(157-158):15-21.

［6］Smirnov SP，Barzaghi P，McKee KK，et al.Conjugation of LG domains of agrins and perlecan to polymerizing laminin-2 promotes acetylcholine receptor clustering［J］.J Biol Chem，2005，280(50):41449-41457.

［7］Ohno K.Genetic defects and disorders at the neuromuscular junction［J］.Brain Nerve，2011，63(7):669-678.

［8］Bajanca F，Luz M，Raymond K，et al.Integrin alpha6beta1-laminin interactions regulate early myotome formation in the mouse embryo［J］.Development，2006，133(9):1635-1644.

［9］Casar JC，Cabello-Verrugio C，Olguin H，et al.Heparan sulfate proteoglycans are increased during skeletal muscle regeneration:requirement of syndecan-3 for successful fiber formation［J］.Cell Sci，2004，117(1):73-84.

［10］Henriquez JP，Casar JC，Fuentealba L，et al.Extracellular matrix histone H1 binds to Perlecan，is present in regenerating skeletal muscle and stimulates myoblast proliferation［J］.Cell Sci，2002，115(10):2041-2051.