糖皮質激素對哮喘小鼠CD4+CD25+調節性T細胞和TLR4表達的影響

龐 英，李 敏，張劍波，姚 斌

(四川省醫學科學院·四川省人民醫院a.兒科，b.醫學中心實驗室，四川 成都 610072)

支氣管哮喘是兒童時期常見的慢性呼吸道疾病，越來越多的研究表明，CD4+CD25+調節性T細胞(regulatory T cells，Tr)在哮喘的免疫調節中發揮重要作用［1］，且CD4+CD25+Tr自身存在多種 Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)表達，TLR信號可以直接影響其功能［2］。本研究通過建立哮喘小鼠動物模型，探討CD4+CD25+Tr及該細胞上的TLR4的表達在哮喘發病中的變化，并觀察糖皮質激素對其影響，現將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗對象 雌性BALB/c小鼠30只，SPF級，6～8周齡，體重(22.12±2.52)g，購于四川大學華西實驗動物中心，按隨機數字表法分為三組:正常對照組(NS組)、哮喘組(OVA組)和哮喘糖皮質激素治療組(OVA/GC組)各10只，分籠飼養，喂食不含致敏原的特殊飼料。

1.2 儀器與試劑 主要實驗儀器有低速離心機，由科大創新股份有限公司中佳分公司提供;壓縮霧化吸入器，由臺灣雅博股份有限公司提供;CYTOMICSFC500流式細胞儀由美國BACK MAN COULTER公司提供等。主要實驗試劑包括雞卵蛋白，購于美國Sigma公司;氫氧化鋁(分析純)，購于成都天成化學試劑廠;小鼠淋巴細胞分離液，購于天津TDB生物技術發展中心;Anti-Mouse CD4 PE-Cy5、Anti-Mouse CD25 PE、Anti-Mouse CD284(TLR4)AlexaFluor 488及相應同型對照等，購于美國eBioscience公司。按操作說明書進行操作和配制。

1.3 動物模型制備 參照沈華浩等［3］和 Sakai等［4］提出的方法略加調整制備哮喘動物模型。即分別于實驗當日和第14天NS組予以生理鹽水0.2 ml腹腔注射，OVA組、OVA/GC組小鼠采用腹腔注射OVA/Al(OH)3混合液致敏0.2 ml(含OVA 100 μg，AL(OH)32 mg);從實驗第21天起開始，NS組用37℃生理鹽水霧化吸入30 min，OVA組、OVA/GC組以2%OVA每天霧化30 min，連續霧化5天激發制備哮喘模型，OVA/GC組于每次激發前30 min腹腔注射地塞米松(1 mg/kg)。

1.4 分離脾單個核細胞 末次激發后24 h引頸處死小鼠。取出脾臟，剪成1～2 mm大小的小塊置于不銹鋼細胞篩上研磨、過濾后，采用密度梯度離心法分離制備脾組織單個核細胞懸液，調節細胞濃度為106個細胞/ml，流式細胞儀檢測各組CD4+CD25+Tr占CD4+T細胞的百分率及CD4+CD25+Tr上的TLR4平均熒光強度。

1.5 肺組織病理切片制備 取出小鼠左肺，投入4%多聚甲醛溶液中固定48 h，經脫水與透明、石蠟包埋，切成5 μm厚薄片，HE染色，觀察肺組織形態結構及炎癥情況。

1.6 統計學方法 采用SPSS 18.0統計軟件對資料進行分析，實驗檢測數據以均數±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析;兩變量間相關性采用直線相關分析法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 肺組織病理改變 OVA組小鼠霧化過程中出現了明顯的類似人類哮喘急性發作癥狀:煩躁不安、抓耳撓腮或安靜少動、呼吸加快加深、口唇紫紺、二便失禁等癥狀，哮喘地塞米松治療組上述癥狀明顯減輕，生理鹽水對照組除可見煩躁不安，無其他上述表現。肺部病理表現見圖1。

圖1 肺組織病理切片(HE染色，×200)a:NS組氣道及血管周圍未見炎癥改變;b:OVA組氣道及血管周圍均可見灶狀以嗜酸性粒細胞增多為主炎性細胞浸潤;c:OVA/GC組炎癥較OVA組明顯減輕

2.2 各組小鼠脾單個核細胞CD4+CD25+Tr百分率及該細胞上表達的TLR4平均熒光強度值變化見表1。OVA組小鼠脾單個核細胞CD4+CD25+Tr百分率明顯降低(P＜0.01)，但該細胞上表達的TLR4平均熒光強度值較NS組無明顯差異(P＞0.05);糖皮質激素干預后哮喘小鼠CD4+CD25+Tr百分率及該細胞上表達的TLR4平均熒光強度明顯升高(P＜0.01)，而升高后的CD4+CD25+Tr百分率略高于 NS組小鼠，但差異無統計學意義(P＞0.05)。

表1 各組小鼠脾單個核細胞CD4+CD25+Tr百分率及該細胞上的TLR4平均熒光強度比較

2.3 各組脾單個核細胞CD4+CD25+Tr表達的TLR4平均熒光強度值與CD4+CD25+Tr百分率相關性分析 數據資料正態分布，pearson相關分析結果表明，NS組、OVA組和OVA/GC組小鼠脾單個核細胞CD4+CD25+Tr上表達的TLR4平均熒光強度值與CD4+CD25+Tr百分率均無相關性，r分別為:0.282，0.365，0.356，均 P ＞ 0.05。

3 討論

近年來研究發現，CD4+CD25+Tr細胞是維持外周免疫耐受的關鍵細胞，在哮喘的免疫調節中發揮重要作用［1］。本實驗中哮喘小鼠脾單個核細胞CD4+CD25+Tr細胞百分率較對照組小鼠明顯降低，與我們前期報道一致［6］。進一步證實了哮喘小鼠確實存在CD4+CD25+Tr細胞數量不足，可能減弱了對Th2細胞的接觸性抑制作用，使Th2型免疫反應增強，導致機體全身和局部免疫紊亂，造成哮喘過敏性氣道炎癥的發生。

TLR4是一種模式識別受體。它通過病原體相關的分子模式釋放細胞因子可誘導樹突狀細胞(dendritic cell，DC)成熟、促進T細胞分化和調節肥大細胞反應，從而在哮喘免疫和宿主保護中起重要作用［7］。Carmalho等［2］發現 Tr有 TLR4、5、7、8 表達，用 LPS 體外刺激CD4+CD25+Tr上的TLR4可直接誘導CD4+CD25+T細胞存活和增殖反應。本研究發現哮喘模型小鼠與正常小鼠CD4+CD25+Tr上的TLR4平均熒光強度值無明顯差異;分析原因考慮可能與OVA不是TLR4的配體，不能刺激TLR4的表達有關。

糖皮質激素是治療和控制哮喘最有效及首選藥物。本研究發現 OVA/GC組小鼠脾臟 CD4+CD25+Tr百分率較OVA組明顯增加。與我們前期的實驗結果一致［6］。提示糖皮質激素可通過調節哮喘體內CD4+CD25+Tr數量，改善其免疫抑制功能，從而發揮治療作用。本實驗結果顯示糖皮質激素治療哮喘小鼠后CD4+CD25+Tr上的TLR4平均熒光強度表達較未治療的哮喘模型小鼠明顯增高。提示糖皮質激素可促進CD4+CD25+Tr上的TLR4的表達，其機制目前尚不十分清楚，相關報道不多。有資料提示，熱休克蛋白90為 TLR4的配體［9］，糖皮質激素作用過程中解離的熱休克蛋白90可能促進了CD4+CD25+Tr上的TLR4的表達。

本實驗進一步分析發現，OVA組小鼠CD4+CD25+Tr百分率較正常明顯下降，但其表達的TLR4平均熒光強度無明顯變化;OVA/GC組CD4+CD25+Tr上的TLR4表達與CD4+CD25+Tr的百分率無相關性。原因考慮為CD4+CD25+Tr上的TLR4未參與OVA誘發哮喘的發病機制;Moser等［10］發現，地塞米松作用后的DC對T細胞的多次重復刺激可以誘導產生CD4+CD25+Tr。提示糖皮質激素可能除直接促進CD4+CD25+Tr上的TLR4表達外還可能通過對DC的作用，而誘導CD4+CD25+Tr的產生。因此，糖皮質激素對CD4+CD25+Tr增殖的調節可能是多種免疫細胞共同參與的結果，促進CD4+CD25+Tr上TLR4的表達而增加CD4+CD25+Tr數量可能只是糖皮質激素促進CD4+CD25+Tr數量增加的其中一個部分。

綜上所述，CD4+CD25+Tr數目的減少，可能減弱對Th2細胞的接觸性抑制作用，使Th2型免疫反應增強，造成哮喘過敏性氣道炎癥的發生，這可能是哮喘發病的機制之一。而CD4+CD25+Tr上的TLR4對OVA誘發哮喘的發病沒有作用;當糖皮質激素治療后，可使體內的 CD4+CD25+Tr數量和TLR4表達明顯增加，這可能是糖皮質激素發揮免疫抑制作用的機制之一。因此，進一步研究TLR4與CD4+CD25+Tr在哮喘發病中的作用機制，將有助于闡明哮喘的免疫發病機制，為今后哮喘的免疫治療提供理論基礎。

［1］李敏，胡林兵，陶沛.胃幽門螺桿菌感染與哮喘急性發作及CD4+CD25+T細胞的作用機制研究［J］.實用醫院臨床雜志，2011，8(2):68-70.

［2］Caramalho I，Lopes-Carvalbo T，Ostler D.Regulatory T cells selectively express toll like receptors and are activated by lipopolysaccharide［J］.J Exp Med，2003，197(4):403-411.

［3］沈華浩，王蘋莉.支氣管哮喘小鼠模型應用評價［J］.中華結核和呼吸雜志，2005，28(4):284-286.

［4］Sakai K，Yokoyama A，Kohno N，et al.Effect of different sensitizing doses of antigen in a murine modle of atopic asthma［J］.Clin Exp Immune，1999，118(1):9-15.

［5］van Oosterhout AJ，Bloksma N.Regulatory T-lymphocytes in asthma［J］.Eur Respir J，2005，26(5):918-932.

［6］李敏，宋麗，張劍波，等.糖皮質激素對哮喘小鼠CD4+CD25+調節性T細胞的作用［J］.中國當代兒科雜志，2008，10(4):527-530.

［7］蘇苗賞，李昌崇.Toll樣受體與支氣管哮喘免疫調控［J］.國外醫學兒科學分冊，2005，32(2):92-94.

［8］Galon J，Franchimont D，Hiroi N，et al.Gene profiling reveals unknown enhancing and suppressive actions of glucocorticoids on immune cells［J］.Faseb J，2002，16(1):61-71.

［9］蘇苗賞，李昌崇，林立，等.地塞米松對年幼期哮喘大鼠Toll樣受體4信號轉導的調節機制［J］.中華兒科雜志，2006，44(12):937-940.

［10］Moser B，Brandes M.γδ T cells:an alternative type of professional APC［J］.Trends Immunol，2006，27(3):112-118.