貴州黔南煙草馬鈴薯Y病毒（PVY）株系的血清學鑒定

羅紅香，李余湘，劉會忠，徐明勇，王林玉，趙中匯，何玉安，李章海，江 彤

（1.貴州省黔南州煙草公司，貴州 都勻 558000；2.中國科學技術大學煙草研究中心，合肥 230051；3.安徽農業大學植保學院，合肥 230036）

馬鈴薯Y病毒（Potato virus Y，PVY）是馬鈴薯Y病毒屬（Potyvirus）的典型成員，能侵染煙草、馬鈴薯、番茄和辣椒等多種茄科作物[1]。根據PVY的鑒別寄主癥狀反應和血清學反應類型，進一步將其劃分為多個株系，常見的有PVYO、PVYN和PVYC等株系。PVYO在不同馬鈴薯品種上引起輕重不一的花葉，而在煙草上引起斑駁和花葉；PVYN在馬鈴薯上一般表現為葉片無癥或輕型斑駁，而在煙草上引起葉脈和葉柄壞死；PVYC在馬鈴薯栽培品種上引起條痕花葉癥狀[2-3]。

我國植病工作者在上世紀 90年代以來也做過一些PVY株系鑒定工作。吳元華等[4]鑒定東北煙區煙草上發生的 PVY有普通株系（PVYO）、脈壞死株系（PVYVN）、點刻條斑株系（PVYC）和莖壞死株系（PVYNS）4個株系。王勁波等[5]鑒定山東煙區主要有PVYO和PVYN2個株系。江彤等[6]鑒定安徽煙草可能存在PVYO株系和PVYNTN株系。由于PVY不同株系發生復合侵染以及不斷發現新的PVY株系和亞株系，PVY株系的鑒定變得越來越復雜。PVY侵染煙草引起的馬鈴薯Y病毒病在國內煙區廣泛分布[7-8]，特別在東北煙區和黃淮煙區危害嚴重[9-10]，大幅度降低煙葉產量和質量，成為阻礙煙葉生產的瓶頸。近年來，貴州省煙草馬鈴薯Y病毒也呈現逐年加重趨勢，特別是黔南煙區 PVY大面積流行，在局部地區甚至造成毀滅性損失[11]。

為減輕貴州黔南煙草病毒病危害，摸清當前貴州黔南煙區馬鈴薯Y病毒病發生發展的變化趨勢，鑒定黔南煙區 PVY株系已成為當務之急。本研究采用以 Tas-ELISA為主的血清學檢測手段來鑒定PVY株系，血清學鑒定方法較快速且可短時間鑒定大量樣本，因此，利用血清學方法加強對黔南煙草上 PVY的株系變化進行系統鑒定和檢測，明確黔南煙草 PVY株系的分布，將為選育適合黔南煙區PVY重病區種植的抗病品種以及制定煙草PVY的防治措施提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 病樣來源 2010年從貴州省黔南州甕安、福泉、貴定、龍里4個縣煙草產區共采集201個表現明顯馬鈴薯Y病毒病癥狀的煙草樣本。樣本表現為葉脈壞死、葉緣縱向下卷、葉片葉面皺縮、脈間輕花葉、矮化等癥狀。其中甕安縣珠藏鎮、牛場壩鄉；福泉縣龍昌鎮；貴定縣新浦鄉、新巴鎮；龍里縣巴江鄉、洗馬鎮的樣本數分別為34、28、36、44、7、27、25個。

1.1.2 試劑 馬鈴薯 Y 病毒各個株系診斷試劑：Potato Virus Y necrotic strain Reagent Set，Potato Virus Y strain C Reagent Set，Potato Virus Y strains O and C Reagent Set（美國Agdia公司）；堿性磷酸酶標記的羊抗鼠IgG（Promega公司）；硝基苯磷酸酯鈉鹽（Sigma公司）；96孔酶標板（美國Corning公司）。

1.2 試驗方法

Tas-ELISA檢測方法參照Agdia公司馬鈴薯Y病毒各個株系診斷試劑使用說明并略加調整。PVY多克隆抗體1:200稀釋后分別包被酶標板，4 ℃孵育過夜；加入1:10稀釋的病汁液樣品，25 ℃孵育2 h；加酶標記物稀釋液（含A酶標抗體和B酶標抗體），25 ℃孵育2 h；硝基苯磷酸酯鈉鹽（PNP）顯色，25 ℃孵育1 h，酶標儀測定吸光值（OD405）。每步用含吐溫的磷酸鹽緩沖液（PBST）洗滌3～5次，測定時每個樣品均設2次重復。

2 結 果

黔南州甕安、福泉、貴定、龍里4縣201個煙草樣本的ELISA檢測結果見表1。從表1可看出，201個樣本中，共檢測出171個樣本受到PVY侵染，陽性率為85.1%。其中甕安、福泉、貴定、龍里PVY的陽性率分別為88.7%、75.0%、80.4%、92.3%。

171個受PVY侵染的樣本中，PVYN37個，占21.6%；PVYO133個，占77.8%；PVYC0個，PVYN和 PVYO復合侵染 1個，占 0.6%。其中，甕安縣55個陽性樣本全部是PVYO，占100%；福泉縣27個陽性樣本中，PVYN占11.1% ，PVYO占88.9%；貴定縣 41個陽性樣本中，PVYN占 34.1%，PVYO占65.9%；龍里縣48個陽性樣本中，PVYN占41.7%，PVYO占56.3%，PVYN和PVYO復合侵染占2.1%。侵染黔南州煙草的 PVY株系分布具有一定規律，PVYO在4縣分布均為主要株系，PVYN侵染相對較少，為次要株系，所有樣本均沒有檢測到PVYC侵染，復合侵染零星發生。

表1 貴州省黔南州201個煙草樣本的PVY株系鑒定結果Table 1 The results of ELISA detection of 201 of tobacco samples from Qannan, Guizhou

3 討 論

從貴州省黔南州甕安、福泉、貴定、龍里4縣采集煙草樣本時發現，黔南煙區疑似感染 PVY的煙株普遍表現為葉脈壞死、葉緣縱向下卷、葉片葉面皺縮、脈間輕花葉、矮化等癥狀。ELISA檢測進一步證明，葉片背面支脈壞死的煙株基本都能檢測到 PVY的侵染，但 PVY在煙草上的癥狀表型與PVY株系之間沒有明確的關系，無論 PVYN還是PVYO都在煙草上表現出葉脈壞死癥狀。因此，根據脈壞死癥狀僅可以初步診斷煙株受到PVY侵染，但無法確定 PVY的株系，必須進一步通過血清學檢測才可以明確PVY的株系類型。

本試驗采用 Tas-ELISA檢測了黔南煙草 PVY的3個株系PVYN、PVYO和PVYC，發現侵染黔南煙草的PVY以PVYO為主，PVYN為次要株系。黔南 PVY株系分布在該地區具有一定規律，甕安縣位于黔南州的最北部，感染甕安煙草的 PVY樣本全部是PVYO，沒有檢測到PVYN侵染；福泉縣位于甕安縣南部，該縣煙草樣本以PVYO侵染為主，也能檢測到少量PVYN侵染。貴定縣的新浦鄉、新巴鎮以及龍里縣的巴江鄉、洗馬鎮相距不遠，位于黔南州的西部。總體上，這4個鄉鎮煙草樣本仍然以 PVYO侵染為主，但龍里縣巴江鄉煙草樣本以PVYN侵染為主，占66.7%（數據未列出），與其他地方PVYO為優勢株系有差異。貴定縣新巴鎮煙草PVY發病很輕，田間病株率低于1%（數據未列出），可能與該鎮處于相對較封閉的山區，高帶毒率的介體蚜蟲尚沒有大量遷入有關。

筆者在黔南州采樣時，也做了PVY病情普查。甕安縣PVY發病最為嚴重，發病田塊病株率30%～70%（數據未列出）不等，病情特別嚴重田塊呈枯黃一片，后期無法控制，煙農甚至棄烤。有的煙農因為馬鈴薯 Y病毒病損失巨大，不愿意再種植烤煙，PVY造成的危害和損失在黔南煙區已成為烤煙生產瓶頸。因此，明確黔南煙草 PVY株系分布，為篩選出適合黔南煙草 PVY重病區種植的抗病品種具有重要意義。鑒于黔南煙區以PVYO為優勢株系，進行地方性品種抗病性選育時，就應該選擇PVYO作為接種毒源。另外，黔南PVY株系種類可能隨蚜蟲的遷飛或烤煙品種的改變發生變化，因此，還需要繼續監測黔南煙草PVY株系的變化。

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