云南省煙草疫霉生理小種的初步鑒定

李梅云

（云南省煙草農業科學研究院，云南 玉溪 653100）

煙草黑脛病是煙草（Nicotiana tabacumL.）生產上的毀滅性病害之一，是制約我國各煙區煙葉生產的最重要因素[1-3]。經驗證明，以抗病品種為中心的綜合防治，能有效控制煙草黑脛病的為害[4]。在實施綜合防治計劃中，應注意的重要問題之一就是煙草黑脛病菌的變異性。在煙草的生產過程中，新的高毒力菌系或新的生理小種的出現，往往使一批抗病品種“喪失”抗病性而成為感病品種，造成病害大流行。研究煙草黑脛病菌生理小種的變化和組成及其與寄主抗性間的關系，對煙草抗黑脛病育種工作極為重要。為此，筆者所在課題組于 2004—2005年從云南各主要產煙州、市分離純化84株黑脛病菌，進行了致病性測定，2006—2008年對 55個地方代表菌株進行生理小種鑒別。

1 材料與方法

1.1 試驗時間、地點

試驗于2004—2008年在云南省煙草農業科學研究院研和試驗基地溫室與實驗室進行。

1.2 試驗材料

1.2.1 供試菌株與品種 所有菌株均采自云南各主要產煙地州，于2004—2005年間先后分離純化。鑒別寄主包括 N.plumbaginifolia、N.nudicaulis、NC1071、L8，抗病對照品種K326和感病對照品種小黃金1025。

1.2.2 培養基與試劑 燕麥液體培養基用于搖床加富培養，固體培養基用于菌株活化與培養，加0.05 g/mL氯霉素用于病原的分離與純化。

蔗糖-檸檬酸-維生素-無機鹽（SCBM）液體培養基[3]：蒸餾水1000 mL、蔗糖30 g、檸檬酸20 g、氯化鈣1.0 g、硝酸鉀2.0 g、磷酸二氫鉀0.67 g、磷酸氫二鉀0.33 g、1%三氯化鐵10滴、VB1 1 mg。TTC液體培養基為上述培養基中加入0.05%TTC；TTC固體培養基為燕麥瓊脂培養基內加入0.05%TTC。

1%糖標準混合溶液：取果糖、葡萄糖、蔗糖各1 g，混合后75%酒精溶解定容至100 mL。苯胺-二苯胺-磷酸顯色劑：1 g二苯胺溶于1 mL苯胺、5 mL 85%磷酸、50 mL丙酮組成的混合溶液中。漂白粉濾液：稱取10 g漂白粉溶于140 mL水中，過濾。現配現用。

1.3 試驗方法

1.3.1 致病性測定 供試菌種燕麥瓊脂培養基28 ℃培養7 d。煙苗移栽前2周，挑取菌絲體接種培養液，120 r/min、28 ℃搖床培養2周，驟然降溫，制成游動孢子懸浮液。調節游動孢子懸浮液濃度 108CFU/mL，備用。

供試品種漂浮育苗，待煙苗長到6～8葉期移栽到塑料花盆（Φ16 cm）中，緩苗生長10 d。

菌株孢子懸浮液灌根接種紅花大金元 10葉期左右大小煙株。具體方法：在煙苗莖基部劃一傷口，游動孢子懸浮液灌根接種于傷口處，脫脂棉保濕。每株15 mL，每菌株設3個重復，每重復15株，設清水對照，接種3 d后開始進行調查，按照嚴重度分級標準進行分級，計算發病率與病情指數[5]。

1.3.2 溫室中生理小種的鑒定 從致病性測定試驗中挑選出強致病力菌株、中致病力菌株、弱致病力菌株3個菌系共55個代表菌株進行生理小種鑒定。將供試菌株的游動孢子懸浮液分別接種6個供試品種煙苗。每菌株設3次重復，另設清水對照，3 d后開始進行病害分級調查，計算病情指數并根據抗性評價標準[6]進行抗性評價。結合前人煙草黑脛病菌0、1、2和3號小種的寄主反應[3,7-11]判斷生理小種類型（表1）。

表1 煙草黑脛病菌0、1、2和3號小種的寄主反應Table 1 Host reaction of Phytophthora parasitica var.nicotianae race 0, 1, 2 and 3

1.3.3 生理生化鑒定 根據溫室生理小種鑒定結果，從中取代表菌株 18個，包括各種抗感病反應類型，分別用三氯苯基四唑氮（TTC）法與硅膠層析法對煙草黑脛病菌菌株所屬生理小種進行鑒別。

供試菌株在 TTC固體培養基平板上的顏色變化：TTC法測定的病菌在SCBM固體（pH 5.5）培養基28 ℃恒溫培養，培養基分別加TTC（0.05%，w/v）和不加2種處理，定期觀察菌落生長和顏色反應。每處理設3個重復，以不加TTC的燕麥瓊脂培養基為對照，觀察顏色反應。

硅膠G層析分析各菌株中的糖分：用于硅膠層析的菌懸液來自SCBM液體培養。取培養9 d的菌懸液準備病菌菌株層析樣品時，菌懸液先用紗布過濾，去掉菌絲體，液體部分離心（700 rpm，10 min）沉淀剩余菌體，上清液作為層析樣本使用。沒有培養過病菌的培養基原液同樣離心，上清液用作對照。用移液器吸取樣品1.5 μL點樣，吹干。將一端放入盛有展層溶劑的層析缸中，當展層溶劑到達距薄析頂端約1 cm處時取出薄板，60 ℃烘箱烘干，顯色。標注液為 1%的蔗糖、葡萄糖和果糖混合溶液，展層劑溶液含正丁醇、冰醋酸、乙醚和水(9:6:3:1)，顯色劑為苯胺－二苯胺－磷酸顯色劑。層析完成后計算 Rf值，公式為 Rf＝h/H，其中，h為原點到色斑中心距離，H為原點到展層劑前沿的距離。

2 結 果

2.1 致病性

2004年分離的 39株煙草黑脛病菌致病率22.22%～100%，平均發病率93.73%，未接種植株沒有發病。病指 2.8～25.0有 17株，占總菌株數的43.59%；病指 25.1～60.0有 10株，占 25.64%；病指60.1～100.0有12株，占30.77%。2005年分離的45個菌株致病率在 66.67%～100%，平均發病率為96.05%，未接種植株沒有發病。病指16.7～25.0有7株，占15.56%；病指25.1～60.0有10株，占22.22%；病指60.1～80.0有20株，占44.44%；病指80.1～100.0有8株，占17.78%。

2.2 生理小種的初步鑒定

對照煙草黑脛病菌0、1、2和3號小種的寄主反應（表2），供試55個菌株中，第1種反應類型33個菌株可確定為0號生理小種，第2種反應類型9個菌株和第3種反應類型8個菌株對NC1071、N.nudicaulis和N.plumbaginifolia抗病，但由于L8品種的葉對0號生理小種感病，根據寄主對病菌的抗性，可以判斷這17個菌株為0號或3號生理小種，究竟是0號還是3號小種可通過生理生化方法判斷。剩余的5個菌株中51～54號4個菌株對L8表現抗病，說明它們不是1或3號生理小種，28#菌株對L8與NC1071表現中感，對N.nudicaulis和N.plumbaginifolia表現抗病，究竟是屬于新的分化類型還是由于它們的致病力懸殊引起的，需進一步鑒定。

表2 各分離菌株生理小種的初步鑒定Table 2 Preliminary race indentification of Phytophthora parasitica var.nicotianae

2.3 生理生化鑒定

2.3.1 供試分離物在 TTC固體培養基平板上的顏色變化 18個菌株在TTC固體培養基中均產生變色反應（圖1、表3）。各分離物在TTC固體培養基上生長時，先移入的菌塊呈紅色，繼而伸入基質的菌絲變色，自培養皿背面觀察菌落擴展呈放射狀，外緣菌絲顏色稍淺，氣生菌絲均為白色絮狀。顯微鏡下觀察與一般菌絲相似，無顏色變化及生長差異。生長120 h后，05P47、05P66、28#三個分離物的菌絲顏色較淺，05P22、05P33、05P35、05P59、26#、62803分離物的菌絲顏色稍淺，但這些分離物的氣生菌絲都茂盛，這可能與分離物在燕麥瓊脂培養基上的代謝特點有關。

圖1 分離物在TTC培養基的變色反應Fig.1 Color change of Phytophthora parasitica var.nicotianae (Ppn) strains

在燕麥+TTC固體培養基上生長時，煙草黑脛病菌0號和1號小種產生脫氫酶，該酶作用于TTC產生紅色脂溶性化合物（圖1），另外兩個小種不產生脫氫酶，用含 TTC培養基培養時不顯紅色[12]。根據培養基的顯色反應區別煙草黑脛病菌小種時，通常觀察到72 h即做出能否顯色的判斷。根據培養物引起“燕麥+TTC”固體培養基顏色變化的情況，18個待測菌株均顯示0號和1號小種的特征。

2.3.2 硅膠 G層析分析各分離物培養濾液中的糖分 硅膠層析是鑒定煙草黑脛病菌生理小種的重要方法，通過檢測病菌利用碳水化合物的代謝產物，幫助判斷小種歸屬。硅膠層析試驗通常使用標準的糖溶液，與待測樣本同時進行試驗，根據層析帶型和用作標準的糖類在層析板上的遷移率（Rf），通過比較，確認待測樣本所含糖的種類。對照表4對比各色斑顏色和Rf值大小證實A為葡萄糖、B為果糖、C及原液CK為蔗糖。D色斑的Rf值最小且與其他值有明顯差異，其色斑顏色也與標準樣的任何一種不相同，據John L.Mcintyre的報道應為蔗果三糖。據報道只有黑脛病菌0號和1號小種經代謝能產生蔗果三糖，3號小種不能產生。我們試圖用這個方法鑒別云南菌株是0號還是1號小種，結果表明，18個待測菌株均能產生蔗果三糖，仍然只能歸為0號或1號小種（圖2，表4）。無論是層析帶型還是Rf值的相對大小，都表明來自云南的18個菌株即符合0號小種的特征，也符合1號生理小種的特征，與TTC培養基鑒別結果一致。

表3 各分離物在TTC固體培養基隨時間的顏色變化Table 3 Color change with time after incubating Ppn on TTC medium

3 討 論

圖2 各供試菌株硅膠G層析后現色結果Fig.2 Thin-layer silica gel chromatography on glass plates was used to visualize products

表4 層析板色斑Rf值比較Table 4 Rates (Rf values) of sugar flow during thin-layer silica gel chromatograph

依據鑒別寄主的反應，1～33號菌株鑒定結果為0號生理小種；34～50號菌株依據鑒別寄主的反應，為0號或3號生理小種，TTC培養基、硅膠G薄層層析的鑒定結果否定了它們為 3號生理小種的可能，說明L8表現中感或感病是因為L8葉片的特殊反應引起的，由此確定34～50號菌株為0號生理小種；51～54號4個菌株對L8表現抗病，說明它們不是1或3號生理小種，它們對NC1071、N.nudicaulis和N.plumbaginifolia中的2個鑒別寄主表現抗病，對另外1個鑒別寄主表現中度感病，也不完全符合0、2號生理小種的判斷；28#菌株對L8與NC1071表現中感，對N.nudicaulis和N.plumbaginifolia表現抗病，所以不是1號生理小種，根據TTC培養基與硅膠層析鑒定結果，應為0號或1號生理小種，51～55號菌株究竟是不是0號生理小種還是屬于新的分化類型，還是由于他們的致病力懸殊引起的，需要進一步深入研究。根據以上研究結果，供試55個煙草黑脛病菌中有50個菌株為0號生理小種，占供試菌系的90.91%，由此說明云南省煙草黑脛病菌優勢菌為0號生理小種，在本次鑒定的供試菌株中未發現1、2、3號生理小種。

黑脛病菌0號、1號小種可以使TTC培養基變色，其基本機制是脫氫酶與TTC發生氧化還原反應生成有色物。至于TTC與脫氫酶作用的具體機制，染色深淺與TTC含量、培養基成分有無直接或間接關系尚待進一步研究。黑脛病菌能分泌水解酶，將蔗糖水解為果糖、葡萄糖而被同化，蔗果三糖由兩個果糖和一個葡萄糖組成。至于該復合物究竟在生化反應過程中的哪一個步驟產生有待進一步研究。

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