周期性張應力對骨性關節炎軟骨細胞p38 MAPK表達及其磷酸化的影響*

劉興漠，項禹誠，孫 青，潘 滔，黃 帥，王德春

(中山大學附屬第六醫院骨科，廣東 廣州 510655)

骨性關節炎(osteoarthritis，OA)是關節疾病中最常見的類型之一，其病理過程以軟骨細胞的凋亡和軟骨基質的破壞為特征。研究證實異常的應力刺激會造成軟骨細胞功能下降、失調，使基質合成減少，從而導致關節退變的啟動及發展［1］。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen－activated protein kinase，MAPK)途徑是真核細胞轉導細胞外信號(包括力學信號)到細胞內，引起細胞內反應的一類重要信號系統。目前研究最多的主要集中在其家族的3個成員上:細胞外信號調節激酶1/2(ERK1/2)、c－Jun N末端激酶(JNK)以及p38 MAPK。我們前期研究已證實，在關節軟骨缺損和OA的動物模型中，軟骨細胞過度表達基質金屬蛋白酶類(matrix metalloproteinases MMPs)［2］。本次實驗利用 Flexercell－4000 型力學加載系統對OA軟骨細胞加載強度不同的周期性張應力(cyclic tensile strain，CTS)，觀察 OA軟骨細胞在 MMPs途徑上游事件中p38 MAPK及其磷酸化產物的活化和表達的變化，揭示軟骨在細胞分子水平上與力學環境的相互作用特點。

材料和方法

1 動物、試劑及儀器

6周齡新西蘭白兔5只，體重2.0～2.5 kg，雌雄不限，由中山大學實驗動物中心提供。實驗過程中動物處置符合動物倫理學標準。反轉錄－聚合酶鏈反應(RT－PCR)試劑盒(上海飛捷生物技術有限公司);BioFlex6孔培養板(Flexcell);Flexercell－4000型力學加載系統(Flexcell);ABI PRISM? 7500 Sequence Detection System(上海碩盟生物科技有限公司);Bio Photometer Plus核酸蛋白測定儀(艾本德中國有限公司);ECL化學發光試劑盒(Amersham);Polytron PT 10－35組織擴散儀(Kinematica)。

2 OA動物造模

根據文獻［3］，5只新西蘭白兔用10 mg/kg戊巴比妥鈉行耳緣靜脈麻醉，隨機逐層切開一側膝部皮膚至關節囊，將髕骨推向外側，暴露關節腔，直視下尖刀切斷前交叉韌帶(輔助檢查前抽屜試驗陽性)，髕骨回位，仔細止血，逐層閉合關節囊和皮膚。術后肌內注射5×105U青霉素，膝關節不固定，置籠內自由活動。

3 膝關節軟骨細胞分離培養

術后10周空氣栓塞處死動物，采用酶消化法分離獲取軟骨細胞。無菌條件下分別切取所有動物雙側膝關節表面軟骨組織，一般以不滲血為度。切成約1 mm×1 mm×1 mm大小碎塊，D－Hanks液沖洗，棄上清，稱重。用0.4%鏈霉蛋白酶(12 mL/g軟骨)37℃、5%CO2培養箱中消化90 min，600 r/min離心5 min。棄上清，用0.025%II型膠原酶(12 mL/g軟骨)37℃、5%CO2培養箱中消化過夜，1200 r/min離心10 min。棄上清，D－Hanks液沖洗，吸取細胞懸液，經100 μm及40 μm細胞篩網過濾于無菌培養瓶內，加入原代軟骨細胞培養液37℃、5%CO2培養箱中培養。

4 CTS加載

非手術側膝關節軟骨細胞為正常組，手術側膝關節軟骨細胞為造模成功的OA細胞，隨機分為3組:OA+低應力組、OA+高應力組和OA對照組。各組細胞均按照1×105/cm2分別接種于6孔BioFlex培養板上，在培養箱內培養約60～72 h，當軟骨細胞達到75% ～80%融合時，吸去原培養基，更換無血清培養液使細胞同步化，12 h后開始加載CTS:OA+低應力組為 sin10%、0.1 Hz、6 h/d，OA+ 高應力組為sin10%、1.0 Hz、6 h/d，正常組與 OA 對照組不予處理，見圖1。首次加載CTS后24 h、1周和2周將各板細胞分裝于Eppendorf管，－20℃凍存以備檢測。

Figure 1.Schematic Flexercell－4000 system.Flexercell flexible hydrophilic cell culture plate surface can reach 200%of the basement membrane elongation and suction gas in the sealed cavity between the basement membrane and the base which resulting a negative pressure and substrate deformation.The gas suction rate through software could be controlled to adjust the bottom of the vertical elastic deformation and the ultimate strength of the force control cells.圖1 Flexercell－4000型力學加載系統示意圖

5 RT－PCR測定MMP13 mRNA及p38 MAPK表達

按試劑盒說明書操作，用Trizol試劑提取總RNA，取1 μL RNA樣品50倍稀釋，在Bio－Photometer Plus核酸蛋白測定儀上測定A值并與內參照(glyceraldehyde－3－phosphate dehydrogenase，GADPH)同時擴增。MMP－13引物序列正義鏈 5'－AGGAGCATGGCGACTTCTAC －3'，反義鏈 5'－TAAAAACAGCTCCGCATCAA－3'。p38 MAPK引物序列正義鏈5'－GATCAGTTGAAGCTCATTTTAA －3'，反義鏈 5'－CACTTGAATAATATTTGGAGAGT－3'，片段長度479 bp。GAPDH 引物序列正義鏈5'－CAAGATTGTCAGCAACGCAT－3'，反義鏈5'－ACAAAGTGGTCATTGAGGGC －3'，片段長度 231 bp。擴增條件為:95 ℃1.5 min，55 ℃ 1 min，70 ℃ 1 min，40個循環。擴增完畢后檢測p38 MAPK mRNA的表達:8 μL產物2%瓊脂糖凝膠電泳，紫外線下攝像。以目的基因與內參照基因條帶的積分吸光度比值檢測基因的表達水平。

6 Western blotting法檢測p38 MAPK磷酸化產物的表達

對上述提取mRNA的樣品繼續提取總蛋白并定量，經10%非變性SDS－PAGE，電轉移至NC膜，特異性抗體雜交反應后ECL顯色，將顯影后所得條帶經掃描保存為*.tiff文件后，采用Totallab 2.01圖像分析軟件對條帶灰度進行分析和比較。

7 統計學處理

采用SPSS 13.0統計軟件包進行統計學分析。數據以均數±標準差()表示，分別對各組檢測結果的數據進行單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 大體觀察

非手術側膝關節無明顯關節積液及滑膜增生，關節軟骨面光滑，色澤明亮，而手術側膝關節術后均腫脹變形，在第10周時關節軟骨均失去原有光澤，顏色明顯變暗，肉眼觀有粗糙感，股骨內外髁部均有圓形軟化灶，股骨雙髁及脛骨內髁關節表面軟骨有缺損，軟骨下骨外露，見圖2，關節液增多，關節囊、滑膜增生，血管翳形成明顯。以上結果顯示OA模型造模成功。

2 各組細胞MMP－13表達

加載CTS 24 h后，正常組和OA對照組之間的MMP－13的表達差異有統計學意義(P＜0.05);加載CTS 2周后OA+低應力組和OA+高壓力組之間差異有統計學意義(P＜0.05);同時發現，OA+低應力組MMP－13的表達持續下降，加載CTS 24 h與2周之間的差異有統計學意義(P＜0.05)，見表1。

Figure 2.Model of rabbit osteoarthritis.Articular cartilage lost the original luster which was dark and with a rough sense.Round malacia and cartilage defects could be found on femoral bicondylar and tibial articular surface.圖2 兔骨性關節炎模型

表1 不同時點各組MMP－13表達Table 1.Expression of MMP－13(.n=5)

表1 不同時點各組MMP－13表達Table 1.Expression of MMP－13(.n=5)

＊P ＜0.05 vs normal;△P ＜0.05 vs OA+high CTS;#P ＜0.05 vs 24 h OA+low CTS.

Group 24h 1 week 2 weeks Normal 0.102±0.035 0.113±0.021 0.103±0.013 OA+low CTS 0.729±0.007 0.518±0.025 0.210±0.045△#OA+high CTS 0.953±0.036 1.007±0.031 1.002±0.006 OA control 0.712±0.017* 0.627±0.021 0.793±0.045△

3 各組軟骨細胞p38 MAPK的表達

OA對照組p38 MAPK表達(1.013±0.012)與正常組相比差異有統計學意義(P＜0.01);加載CTS 1周后OA+高應力組(1.092±0.003)和 OA+低應力組(0.882 ±0.012)的差異有統計學意義(P＜0.05);加載CTS 2周后，p38 MAPK在OA+低應力組和OA對照組分別為0.672±0.011和1.077±0.012，兩組之間有顯著差異(P ＜0.01)，見圖3。

Figure 3.Expression of p38 MAPK..n=5.＊＊P＜0.01 vs normal;△P ＜0.05 vs OA+high CTS.▲▲P ＜0.01 vs OA control.圖3 各組p38 MAPK的表達

4 各組軟骨細胞p38 MAPK磷酸化產物的表達

p38 MAPK磷酸化產物在對照組和OA+高應力組持續表達，而在3個時點OA+低應力組的p38 MAPK磷酸化產物的表達呈下降趨勢，見圖4。

Figure 4.Expression of phospho－p38 MAPK.圖4 磷酸化p38 MAPK的表達

5 p38 MAPK及其磷酸化產物的比值

當CTS載荷為1.0 Hz，3個時點p38 MAPK磷酸化產物與p38 MAPK的比例分別為1.083±0.003、1.069±0.006和1.051±0.011，而強度為 0.1Hz時，比例為 1.072±0.008、1.043±0.004和1.031±0.002。各時點兩組數據之間的差異有統計學意義(均P＜0.05)，見圖5。

Figure 5.Ratio of p38 MAPK and phospho－p38 MAPK..n=5.*P ＜0.05 vs OA+high CTS.圖5 p38 MAPK及其磷酸化產物的比值

討 論

在骨性關節炎的發生和發展過程中，力學因素的作用不容忽視，一方面力學載荷使關節軟骨基質中的黏多糖含量減少，硫酸軟骨素喪失，纖維成分增加，而細胞外基質(extracellular matrix，ECM)各成分的失衡則進一步影響各層軟骨細胞的活性，最終導致軟骨細胞凋亡與基質崩解;另一方面，力學載荷可影響ECM和軟骨細胞的合成，而同時ECM和軟骨細胞也影響著力學載荷對細胞的代謝作用［4］。有研究發現在軟骨分泌的基質分子組成的膠原網中，基質分子遵循有利于軟骨力學功能的原則在膠原網結構中沉積［5］，這說明當力學信號傳導至軟骨細胞表面時，其力學效應通過某種轉導途徑進入細胞核，再進一步調節各種基因表達從而對力學信號做出反饋，即力學信號－生物學信號－基因表達－生物學效應。

正常關節中MMPs與金屬蛋白酶組織抑制因子(tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMPs)的表達量極低。由于各種理化因素的影響，MMPs與TIMPs之間的動態平衡被打破，導致關節軟骨ECM過度降解。大量研究證實，MMPs的過度表達可導致軟骨逐漸出現炎癥、潰瘍、缺損等一系列退行性變［6］。p38 MAPK作為MAPK家族的重要成員，可以調節包括MMPs與TIMPs在內的多種轉錄因子及蛋白酶活性，調控細胞多種生理和病理過程［7］。當軟骨細胞受到力學刺激后，細胞膜表面的力感受器整合素(integrin)通過FAK/SOS/Ras等通道，促使MAPKKK－MAPKK－MAPK的級聯磷酸化。激活的p38 MAPK結合并進一步磷酸化作用底物，底物再與各自的特異性目標結合，引起不同的細胞病理生理反應［8］。MMPs已知有26種，根據其蛋白結構和作用底物的特異性可以分為5個亞型，其中MMP－13的水解底物均為纖維類膠原，并且是MMPs級聯激活途徑中的關鍵MMPs［5］，我們在前期研究中發現，在關節軟骨缺損和OA的動物模型中，關節滑膜中的MMPs mRNA含量較正常滑膜組織明顯增高［2］。因此我們認為在此過程中，MAPK信號轉導途徑作為MMPs的上游事件起到了關鍵作用。本實驗在不同時點進一步檢測各組MMP－13表達時發現，術后24 h正常組與OA對照組差異有統計學意義(P＜0.05)，并且術后2周OA+低應力組與OA+高應力組表達也存在顯著差異(P＜0.05)，更值得一提的是，MMP－13在OA+低應力組的表達隨著時間的推移而逐漸降低，與此同時，OA軟骨細胞p38 MAPK及其磷酸化產物的mRNA表達水平明顯高于正常軟骨細胞，兩者差異有統計學意義(P＜0.05)，這可能與OA軟骨細胞中由炎癥介質(目前多認為是白細胞介素)介導的Janus激酶(JAK)通過磷酸化激活信號轉導子和轉錄激活子(signal transducer and activator of transcription，STAT)有關［9］，而在此過程中 JAK 激活后通過信號交聯MAPK的級聯激活過程，上調p38 MAPK與其磷酸化產物的表達，最終使MMP－13的表達增加。

此外，實驗結果還表明不同強度的應力載荷對OA軟骨細胞產生的生物學效應亦有差別(圖4)。在應力的作用下，p38 MAPK逐步磷酸化，活化的激酶隨后轉移入胞核，通過活化轉錄因子調控特定基因的表達，從而將力學信號刺激從細胞外傳到細胞核，并介導產生包括MMPs在內的多種炎癥因子。本實驗中加載CTS后磷酸化p38 MAPK與p38 MAPK的比值高應力組與低應力組之間的差異有統計學意義(P＜0.05)，表明當應力刺激增高時，p38 MAPK磷酸化產物增多，下游產物(MMP－13)的活化和表達隨之增多，而炎癥因子的過度表達又可以通過正反饋促進MAPK的級聯磷酸化過程，進一步激活p38 MAPK，或者通過不同的信號轉導通路調控特定的基因表達，如白細胞介素介導的JAK磷酸化，最終導致基質崩解與軟骨細胞凋亡［10］。

綜上所述，在軟骨疾病和損傷發生、發展和修復的過程中，力學刺激始終扮演著重要角色。本實驗通過研究軟骨細胞在細胞分子水平上與力學環境的相互作用特點，初步闡明了力學信號－生物學信號－基因表達－生物學效應過程中OA與應力相互影響的“惡性循環”。本實驗的缺點在于未能對應力強度做出定量的衡量，我們將在下一步研究中著重探討。

［1］Drury JL，Mooney DJ.Hydrogels for tissue engineering:scaffold design variables and applications［J］.Biomaterials，2003，24(24):4337 －4351.

［2］劉興漠，項禹誠，麥海民，等.關節軟骨－骨一體化修復體修復全層關節軟骨缺損的實驗研究［J］.中華骨科雜志.2011，31(4):365－371.

［3］Kyriakis JM，Avruch J.Mammalian mitogen－ activated protein kinase signal transduction pathways activated by stress and inflammation［J］.Physiol Rev，2001，81(2):807－869.

［4］Cuenda A，Rousseau S.p38 MAP－kinases pathway regulation，function and role in human diseases［J］.Biochim Biophys Acta，2007，1773(8):1358 －1375.

［5］Han J，Lee JD，Bibbs L，et al.A MAP kinase targeted by endotoxin and hyperosmolarity in mammalian cells［J］.Science，1994，265(5173):808 －811.

［6］Lee JC，Laydon JT，McDonnell PC，et al.A protein kinase involved in the regulation of inflammatory cytokine biosynthesis［J］.Nature，1994，372(6508):739 －746.

［7］Rouse J，Cohen P，Trigon S，et al.A novel kinase cascade triggered by stress and heat shock that stimulates MAPKAP kinase－2 and phosphorylation of the small heat shock proteins［J］.Cell，1994，78(6):1027 － 1037.

［8］Freshney NW，Rawlinson L，Guesdon F，et al.Interleukin－1 activates a novel protein kinase cascade that results in the phosphorylation of Hsp27［J］.Cell，1994，78(6):1039－1049.

［9］Wada Y，Shimada K，Sugimoto K，et al.Novel p38 mitogen－activated protein kinase inhibitor R2130823 protects cartilage by down－regulating matrix metalloproteinase－1，－13 and prostaglandin E2production in human chondrocytes［J］.Int Immunopharmacol，2009，6(2):144 －155.

［10］Link DP，Strandberg JD，Virmani R，et al.Histopathologic appearance of arterial occlusions with hydrogel and polyvinyl alcohol embolic material in domestic swine［J］.J Vasc Interv Radiol，2009，7(6):897 －905.