法尼醇X受體在糖尿病腎病腎組織中的表達及意義

丁涵露，王 莉，汪 偉，鄒玉榮，廖常志，張 萍

(四川省醫學科學院·四川省人民醫院腎內科，四川 成都 610072)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)發病機制不完全清楚，炎癥機制在DN發病中的作用正得到重視，而機體內源性抗炎機制目前研究較少。法尼醇X受體(farnesoid X receptor，FXR)是一種重要的核受體，除參與膽固醇、脂類和葡萄糖等物質代謝過程外［1，2］，還具有重要抗炎作用［3］。巨噬細胞浸潤腎組織引發的炎癥反應是造成DN病變持續進展的重要機制［4］，有關人類DN腎組織FXR表達及其與巨噬細胞浸潤、腎損傷之間的關系目前未見報道，因此，明確FXR在糖尿病腎病腎組織中的表達及其與炎細胞浸潤、腎損傷之間的關系將有助于明確DN炎癥反應的調控。

1 對象與方法

1.1 研究對象 試驗對象15例均為我院2005～2011年住院DN患者(DN組)，其中男7例，女8例，年齡(54±8.5)歲，均經腎活檢組織病理檢查確診為DN。正常組5例，年齡(52±6.9)歲，來自我院腎腫瘤做腎切術但遠離腫瘤部位的腎組織，均經光鏡證實腎組織正常。

1.2 材料 兔抗人FXR多克隆抗體購于美國Ebioscience公司，小鼠抗人CD68單克隆抗體、超敏SP(鼠/兔)免疫組化試劑盒和DAB顯色試劑盒購于北京中杉公司。

1.3 FXR、CD68免疫組織化學染色 石蠟切片4 μm，常規脫蠟、水洗后，3%H2O2室溫 15 min，FXR行EDTA微波修復，CD68行胰酶修復，分別滴加一抗:兔抗人FXR多克隆抗體(稀釋比例為1∶200)和小鼠抗人CD68抗體原液，4℃過夜。次日0.01 mol/L PBS洗5 min×3次后，即按照超敏SP免疫組化試劑盒說明書進行操作，DAB顯色，蘇木精復染細胞核。陰性對照以PBS代替一抗，同法操作。

1.4 腎小球病理損害程度的判定 石蠟切片行HE、PAS等常規染色，PAS染色切片在200倍視野下進行分析，每張切片選擇10個正切的腎小球，計算系膜區擴張指數(以系膜區/毛細血管襻面積比表示)，取平均值作為每個標本的系膜區擴張指數［5］。

1.5 腎小管-間質病理損害程度的判定 根據腎小管擴張程度、腎小管萎縮程度、腎小管上皮細胞空泡變性程度、腎小管上皮細胞壞死程度、間質纖維化程度及腎間質炎癥細胞浸潤程度的無、輕、中、重分別計0、1、2、3，每例樣本觀察10個視野，結果以每例樣本的相加總和平均值表示［6］。

1.6 FXR、CD68陽性細胞結果判斷

1.6.1 FXR免疫組化表達 采用半定量法分析，由兩人在事先不知道標本臨床指標和腎臟病理結果的情況下同時閱片。陽性評分方法:①按陽性范圍記分:無為0分，＜25%為1分，26% ～50%為2分，51% ～75%為3分，＞75%為4分;②按陽性程度記分，0分:無染色;1分:弱陽性;2分:中度陽性;3分:強陽性;4分:極強陽性。③陽性范圍和陽性程度的評分相乘結果，即該例的陽性積分［7］。

1.6.2 CD68表達觀察 每例標本選取皮質腎小管-間質10個高倍視野(×400)計數平均陽性細胞數［7］。

1.7 統計學方法 以SPSS 11.0統計軟件處理數據。計量資料數據以均數±標準差表示，正態計量資料采用單因素方差分析或t檢驗。FXR陽性表達積分與CD68陽性細胞數、臨床指標和腎組織病理變化的相關分析用Spearman等級相關分析。

2 結果

2.1 一般情況 正常組和DN組年齡［(52±6.9)歲 vs(54±8.5)歲］、內生肌酐清除率［(99.7±10.1)ml/(min·1.73m2)vs(92.4±9.7)ml/(min·1.73m2)］差異均無統計學意義(P＞0.05);而DN組患者尿蛋白、低密度脂蛋白膽固醇(LDL)和甘油三酯(TG)水平以及系膜區擴張指數和腎小管病變積分明顯高于正常對照組(P＜0.01)，見表1。

表1 兩組研究對象臨床特征及腎臟病理比較

2.2 FXR和CD68在腎組織中的表達 在正常和DN腎組織中，腎小球系膜細胞、內皮細胞和足細胞、近端腎小管上皮細胞、遠端腎小管上皮細胞及集合管上皮細胞均表達FXR(圖1a、圖2a，表2)，免疫組化陽性染色顆粒主要位于細胞漿中，表達強度正常組較DN組弱。CD68在正常腎組織的腎間質和腎小球無明顯表達(圖1b，表2)，而在DN腎小球和腎小管間質均有CD68表達(圖2b，表2)，陰性對照未見FXR和CD68陽性染色。

圖1 FXR(a)和CD68(b)在正常腎組織中的表達(免疫組化×200);圖2 FXR(a)和CD68(b)在糖尿病腎病腎組織表達增強(a免疫組化×200;b免疫組化×400)

表2 FXR和CD68在腎小球、腎小管-間質內陽性強度積分比較

2.3 FXR陽性表達積分與CD68陽性+細胞積分和臨床指標之間的相關性分析 腎組織內FXR陽性表達積分與CD68陽性細胞數以及LDL和TG水平呈負相關(r分別為－0.742、－0.654、－0.632，P 均＜0.01);FXR陽性表達積分與腎小球系膜擴張指數和腎小管-間質病變呈負相關(r分別為－0.587、－0.636，P均＜0.01)，與24小時尿蛋白定量無相關性。

3 討論

FXR是核受體家族成員中一種重要的核受體，在正常肝臟、腎臟和小腸高表達，初級膽酸是FXR親和力最強的內源性配體。體外試驗發現腎小球膜細胞中FXR過度表達或是以人工合成配體GW4064激活FXR后，能抑制系膜細胞上固醇調控元件結合蛋白-1c(SREBP-1c)及其他生脂基因轉化生長因子(TGF)-β和白細胞介素(IL-6)的表達，從而減輕系膜細胞的脂質和炎癥損害［8］。本試驗發現，FXR主要表達在系膜細胞和腎小管上皮細胞，DN腎組織FXR表達較正常腎組織增強，且與腎小球系膜區擴張指數負相關，推測DN患者系膜細胞增殖和細胞外基質產生增加，FXR代償性表達增加以抑制系膜基質增加。內皮細胞、足細胞損害也是促進DN病變進展的重要機制，有報道FXR可在足細胞、內皮細胞表達［8］，在本研究中我們也發現少量FXR在足細胞和腎小球毛細血管內皮細胞位置表達，可能與其抗炎反應有關。本試驗中，腎小管上皮細胞表達FXR在DN組織較正常組織增強，FXR陽性積分與腎小管間質病變呈負相關，提示FXR可能參與了腎小管間質炎癥反應和纖維化的病變。

DN存在明顯脂代謝紊亂，脂質在腎小球沉積可引起腎小球單核細胞浸潤、泡沫細胞和含膽固醇/膽固醇酯細胞增多，系膜細胞增生及細胞外基質積聚，在表現為I型DN的C57BL/6鼠，當FXR基因敲除后，腎損害較野生型糖尿病C57BL/6小鼠明顯加重，而給予DBA/2J小鼠FXR激動劑INT-747后，腎組織脂質沉積減少，尿蛋白、腎小球硬化、腎間質纖維化、氧化應激減輕，巨噬細胞浸潤減少，FXR配體通過激活Akita和OVE26小鼠腎組織FXR及FXR靶基因小異源二聚體伴侶受體 SHP，抑制SREBP-1和PPARalpha活性，減少脂肪酸、甘油三酯在腎組織的沉積，從而減輕蛋白尿和細胞外基質沉積，說明FXR具有通過調節脂代謝而保護腎組織的作用［8］。本試驗結果顯示，DN患者血 LDL、TG較正常組升高，腎組織FXR表達增加，其陽性積分與血LDL、TG呈負相關，提示腎組織表達FXR增加以加強對LDL、TG的清除，減輕脂質沉積增加所引起的腎損害，但需要進一步觀察腎組織脂質沉積和FXR及其靶信號通路SREBP-1等的表達，以明確FXR在DN脂質腎損害中的作用。

FXR除參與膽固醇、脂類和葡萄糖等物質代謝過程外［1，2］，還具有重要抗炎作用［3］，其在抑制多種器官的炎癥以及全身性炎癥的發生和發展中發揮了重要作用［9～11］。炎癥反應在DN發病機制中占有重要位置，浸潤于腎組織的巨噬細胞通過釋放炎性介質，在DN中起著重要的致病作用［12］，與蛋白尿程度及腎功能衰退密切相關［13］，因此，本研究擬通過觀察FXR表達和巨噬細胞標志物CD68表達，探討FXR與DN炎癥反應之間的關系，結果發現，DN腎組織較正常腎組織，FXR和CD68表達均增加，相關分析顯示，DN腎組織FXR陽性表達積分和CD68陽性表達積分呈負相關。國外研究發現FXR不僅抑制炎癥反應，而且FXR的活化可在轉錄水平抑制NF-KB誘導的炎癥因子，如誘導型一氧化氮合酶(iNOS)、環氧化酶-2(COX-2)、干擾素誘導蛋白10和干擾素 r的表達［9］，下調單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)［2］，因此本研究中表達增強的FXR有可能通過抑制MCP-1表達而抑制巨噬細胞的遷移和浸潤，減輕炎癥反應和腎損害加重，而且在炎癥刺激下，FXR的活性及表達水平被抑制［1］，因此炎癥反應和FXR相互影響而參與DN炎癥反應的發生發展，其具體病理生理意義還需要研究。

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