姜黃素對大鼠神經元凋亡和神經行為學的影響

王 智，薛榮亮，趙紅霞，高 慧，魏 欣

(1.西安交通大學口腔醫院麻醉科，陜西 西安 710004;2.西安交通大學醫學院第二附屬醫院麻醉科，陜西 西安 710004)

臨床上常常能遇到腦缺血疾病造成的腦機能障礙，這主要與腦缺血再灌注損傷以及遲發性的神經元細胞凋亡有關［1］。在腦缺血再灌注損傷機制中，自由基的過度產生所致的氧化應激損傷是其主要原因，因此在腦缺血/再灌注后進行抗氧化干預是減輕腦缺血/再灌注損傷的重要方法。而遲發性的神經元細胞凋亡與腦缺血/再灌注后隨時間推移而漸加重的腦機能障礙密切相關。如何在缺血/再灌注發生后早期發現并且采取有效措施予以干預，對臨床改善患者預后有著極為重要的意義。姜黃素是從姜黃類植物根莖中分離出的一種酚類色素，已有報道顯示其具有抗氧化、抗炎癥及抗癌等功效［2，3］。近年來有部分文獻指出姜黃素通過清除自由基，抑制脂質過氧化和細胞壞死從而改善腦缺血及再灌注后的細胞功能，達到腦保護的作用［4，5］。但是其發揮腦保護作用的具體機制尚不很清楚，而且目前鮮有資料報道姜黃素對全腦缺血再灌注后神經元細胞凋亡以及神經行為功能的影響。本試驗建立了全腦缺血/再灌注大鼠模型，擬研究姜黃素對腦缺血敏感區海馬CA1區細胞凋亡與大鼠神經行為功能的影響，探索討黃素腦保護機制，以期為臨床治療腦缺血/再灌注損傷提供新的思路和理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性SD大鼠216只，鼠齡55～65日，體重290～310 g，由西安交通大學醫學院動物試驗中心提供。術前夜禁食，隨意進水。姜黃素(購自美國Sigma公司)，原位末端標記細胞凋亡檢測試劑盒(購自美國 Promega公司)，DAB顯色試劑盒(購自北京博奧森生物技術有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組 216只大鼠隨機分成3組:假手術組(SH組)、缺血/再灌注組(IR組)、姜黃素干預組(CU組)。其中108只用于細胞凋亡檢測，108只用于神經行為學試驗。每組根據再灌注后處死(或進行神經行為學試驗)時間的不同再分為2、6、12、24、48 和72 h 6 個亞組，每亞組12 只動物。

1.2.2 模型制備 采用四血管阻塞法［6］建立SD大鼠全腦缺血再灌注損傷模型。IR組和CU組動物予以微動脈夾夾閉頸總動脈5分鐘后松開動脈夾以恢復腦血流。SH組大鼠僅游離暴露雙側頸總動脈及椎動脈，不予以凝斷椎動脈和夾閉雙側頸總動脈處理。SH組和IR組動物在全腦缺血再灌注后即時分別腹腔注射生理鹽水4 ml/kg，CU組動物注射依達拉奉溶液10 mg/kg。

1.2.3 原位細胞凋亡檢測法(TUNEL) 按照事先分組選取108只大鼠分別于再灌注后2、6、12、24、48、72 h時處死。以4%多聚甲醛200 ml心臟灌注處死，取出完整大腦，在視交叉后1 mm和4 mm處各切一刀取中間小塊腦組織(海馬頭端)，將組織塊在4%多聚甲醛液中浸泡，4℃保存3d后制備切片。取海馬冠狀石蠟切片，常規二甲苯、乙醇脫蠟至水。蛋白酶K(20 mg/L)室溫消化，用3%過氧化氫一甲醇溶液消除內源性辣根過氧化酶活性，加末端脫氧核糖核酸轉移酶(TdT)與生物素標記的核苷混合物(biotin-11-dUTP)混合反應進行孵育，再加鏈霉抗生物素蛋白辣根過氧化物酶溶液(streptavidin-HRP溶液)進行孵育，用DAB顯色，核呈深棕黃色者為凋亡細胞，最后復染、脫水、透明、封片。400倍光鏡下觀察每張切片海馬CA1區，隨機選取5個視野，分別計算凋亡細胞數和總細胞數。定量分析方法為:光鏡下計算凋亡指數(Apoptosis Index，AI)。凋亡指數計算方法:分別計算凋亡細胞數和總細胞數，AI=凋亡細胞數/總細胞數×100%。

1.2.4 神經行為學檢測 為排除麻醉對大鼠神經行為的影響，僅將再灌注后24、48、72 h三個亞組共54只大鼠進行實驗，其余54只不予處理。①曠場試驗:也稱自發活動(inner open field test)視頻分析系統，是觀察研究試驗動物神經精神變化，進入開闊環境后的各種行為，例如動物對新開闊環境的恐懼而主要在周邊區域活動，在中央區域活動較少，但動物的探究性又促使其產生在中央區域活動的動機，也可觀察由此產生的焦慮心理。大鼠曠場反應箱高40 cm，底邊長100 cm，四壁及底面涂黑。正上方2 m處設有數碼攝像頭，記錄大鼠在曠場內整個活動情況。試驗在安靜無外界干擾的情況下進行，將大鼠放入曠場反應箱底面中心，同時進行攝像和計時，觀察時間根據試驗需要設定為5 min。觀察指標為大鼠中央活動時間比和中央活動路程比。觀察結束后，用10%的酒精清洗反應箱的內壁以及底面，避免上只大鼠的大小便、氣味等影響下只大鼠的測試結果。每只大鼠均按此進行試驗。②高架十字迷宮試驗(EMP):EMP是利用動物對新異環境的探究性和對高懸敞開臂的恐懼形成矛盾沖突行為來考察動物的焦慮狀態。EMP具有一對開臂和一對閉臂，齒類動物由于嗜暗性會傾向于在閉臂中活動，但是出于好奇心和探究性又會在開臂中活動，在面對新奇刺激時，動物同時產生探究的沖動和恐懼，這就造成了探究和回避的沖突行為，從而產生焦慮心理。實驗室應安靜，保持在1.5 m處能夠區分大鼠細微活動的最低亮度，溫度25℃。試驗前將大鼠單獨置于塑料盒中自由探究5 min，后迅速置于高架十字迷宮中央平臺，頭部正對一個開放臂，同時開始進行攝像和計時。時間根據試驗要求設定為5 min。以大鼠的4個爪子均進入某臂為準，任意一爪子完全退出則認為該次進入活動完成。觀察指標為進入開放臂時間比(OT%)，進入開放臂次數比(OE%)。每只大鼠試驗結束后，以10%的稀釋酒精擦洗各臂和中央平臺的底面和四周，每只大鼠均按此進行試驗。

1.3 統計學方法 所有數據應用SPSS 13.0軟件包進行統計學處理，計量資料以均數±標準差表示，組間比較采用雙因素析因方差分析及LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義，P＜0.01為差異有顯著統計學意義。

2 結果

2.1 TUNEL SH組凋亡指數較低;IR組凋亡率于缺血再灌注后6 h開始明顯增多，48 h凋亡指數達到最高，與SH組比較，IR組凋亡指數的增高有顯著性差異(P＜0.01);CU組在6 h后各時點凋亡指數明顯低于IR組，差異有顯著的統計學意義(P＜0.01)，見表1，圖1 ～圖3。

表1 大鼠全腦缺血再灌注后各時點海馬CA1區凋亡指數比較

圖1 光鏡下缺血再灌注48 h SH組海馬CA1區細胞凋亡情況(TUNEL染色，×400);圖2 光鏡下缺血再灌注48 h IR組海馬CA1區細胞凋亡情況(TUNEL染色，×400);圖3 光鏡下缺血再灌注48 h CU組海馬CA1區細胞凋亡情況(TUNEL染色，×400)

2.2 神經行為學檢測

2.2.1 曠場試驗 IR組大鼠曠場中央活動時間比隨缺血/再灌注后時間推移，逐漸縮短，與SH組相比存在統計學差異(P＜0.05);CU組大鼠曠場中央活動時間比在各時點較IR組明顯高，差異有統計學意義(P＜0.05)，見表2。IR組大鼠曠場中央活動路程比隨缺血/再灌注后時間推移，逐漸縮短，與SH組比較差異有統計學意義(P＜0.05);CU組大鼠曠場中央活動路程比在各時點較IR組明顯高，差異有統計學意義(P＜0.05)，見表3。

表2 各時點大鼠中央活動時間比的比較 (%)

表3 各時點大鼠中央活動路程比的比較 (%)

2.2.2 EMP試驗 IR組大鼠OE%隨缺血/再灌注后時間推移，逐漸減少，與SH組相比存在統計學差異(P＜0.05);CU組大鼠OE%在各時點比IR組明顯高，差異有統計學意義(P＜0.05)，見表4。IR組大鼠OT%隨缺血再灌注后時間推移，逐漸縮短，與SH組比較差異有統計學意義(P＜0.05);CU組大鼠OT%在各時點比IR組明顯高，差異有統計學意義(P ＜0.05)，見表5。

表4 各時點大鼠OE%比較

表5 各時點OT%比較

3 討論

在腦缺血再灌注損傷機制中的興奮性氨基酸釋放、鈣超載、線粒體損傷、自由基和一氧化氮等的大量產生，以及凋亡相關基因、凋亡蛋白因子和相關細胞因子的表達都參與了細胞凋亡的過程。劉廣義等［7］報道，鼠腦缺血再灌注后，凋亡細胞主要位于缺血周圍區，損傷、壞死細胞主要位于缺血中心區，隨著缺血再灌注時間的延長，缺血周圍區細胞損傷、壞死逐漸加重。可見腦細胞凋亡是一個動態漸進的演變過程，如果能早期積極采取措施保護尚未凋亡的細胞，則有可能為臨床治療缺血性腦損傷疾病提供一條新的途徑。

姜黃素是一種安全性很高的植物多酚，其抗脂質過氧化、抗自由基損傷作用已得到證實［8］。姜黃索可抑制自由基生成并加強其清除，抑制缺血再灌注大鼠腦組織脂褐質和亞硝酸鹽含量的升高;同時姜黃素還可影響與氧化、抗氧化有關的酶類而發揮強大的抗氧化保護作用，保護生物大分子免遭自由基的毒性作用，從而保護機體組織器官［9］。石晶等［10］提出姜黃素可能通過其抗氧化作用保護線粒體的功能，維持細胞能量代謝，從而增強對再灌注損傷的抵抗力。

本研究通過建立全腦缺血模型，給予姜黃素腹腔注射后，TUNEL法檢測細胞凋亡結果顯示，在缺血敏感區海馬CA1區，IR組自6 h可以觀察到早期凋亡細胞，至48 h達到高峰，一直持續到72 h。CU組在各個時點觀察到的凋亡細胞均較IR組明顯減少，有顯著性差異(P＜0.01)。由此我們得出結論，姜黃素對于腦缺血/再灌注損傷后細胞凋亡具有明顯抑制作用，但其具體機制還需進一步研究明確。

研究表明，姜黃素能改善雙側頸總動脈永久性結扎所致的學習記憶減退，減少自由基的產生以及減少神經細胞死亡［11］。本研究選用曠場試驗和EMP評估大鼠行為學改變。曠場試驗的中央活動路程比和中央區活動時間比可以反映大鼠在缺血/再灌注損傷后活動性的變化、探究能力和情緒狀態。在缺血/再灌注損傷后24、48、72 h三個時點IR組較SH組大鼠中央區活動時間比和中央活動路程比明顯減少，CU組較IR組明顯增加，說明姜黃素可以明顯提高大鼠在缺血再灌注損傷后活動、探究能力，抑制焦慮情緒。在 EMP中，IR組大鼠較 SH組OE%和 OT%明顯減少，CU組較 IR組 OE%和OT%則明顯增加。OE%和OT%反應大鼠的空間探究能力和情緒的敏感性、易激惹性，同樣驗證了姜黃素對全腦缺血再灌注損傷后大鼠行為能力的改善作用。大鼠全腦缺血/再灌注損傷后隨時間推移，細胞凋亡逐漸加重，大鼠的運動能力、空間探索能力降低，焦慮情緒增加。應用姜黃素可明顯抑制神經元凋亡，在對腦結構保護的基礎上，提高大鼠運動能力、空間探索能力，緩解焦慮情緒，改善大鼠神經行為學功能，實現對腦功能的保護。

總之，通過本次研究得出以下結論，大鼠全腦缺血/再灌注損傷后應用姜黃素可以明顯降低海馬CA1區神經元凋亡率，發揮腦保護作用。同時姜黃素可以顯著改善大鼠全腦缺血/再灌注損傷后大鼠的活動性、空間探究能力，抑制焦慮情緒。

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